利用氣相色譜- 質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行高靈敏度的亞硝胺分析

利用氣相色譜- 質(zhì)譜/ 質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行高靈敏度的亞硝胺分析

 

Alex Chen1, Hans-Joachim Huebschmann2, Li Fangyan3, Chew Yai Foong3 and Chan Sheot Harn3

1Alpha Analytical Pte. Ltd., Singapore; 2Thermo Fisher Scientific, Singapore, 3Health Sciences

Authority, HSA Singapore

 

亞硝胺，食品安全，啤酒，TSQ 8000，氣相色譜- 質(zhì)譜/ 質(zhì)譜，定量分析，確認(rèn)，

自動(dòng)SRM，TraceFinder

 

亞硝胺是N- 亞硝基烷基胺一類化合物的通用名。已知的含有不同烷基基團(tuán)的這類化合物有很多。最簡(jiǎn)單的N- 亞硝基烷基胺含有兩個(gè)甲基，即N- 亞硝基二甲基胺(NDMA)。亞硝胺是常見(jiàn)的劇毒化合物，對(duì)人和動(dòng)物都有強(qiáng)致癌性，高劑量的攝入會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷和內(nèi)出血。

 

食物中的亞硝胺主要是由亞硝酸生成的。亞硝酸通常作為防腐劑被添加到肉及肉制品中，以避免肉毒桿菌造成的中毒。維生素等有抗氧化作用的添加劑能抑制亞硝酸向亞硝胺的轉(zhuǎn)化。亞硝胺的另一個(gè)來(lái)源是由氮的氧化物與生物堿（alkaloids）反應(yīng)產(chǎn)生，這一反應(yīng)在啤酒生產(chǎn)時(shí)干燥已萌發(fā)的麥芽的過(guò)程中已有報(bào)道。由于麥芽和啤酒中的亞硝胺水平在發(fā)酵過(guò)程中已大幅降低，需要更好的分析表現(xiàn)才能勝任此檢測(cè)任務(wù)。而除了其它各項(xiàng)日常食品的常規(guī)控制項(xiàng)目之外，啤酒中麥芽的低劑量亞硝胺檢測(cè)也是必須的。

 

已采用多年的“經(jīng)典”亞硝胺檢測(cè)方法是利用串接熱能分析儀（TEA）檢測(cè)器的氣相色譜進(jìn)行分析的。選擇特殊的TEA 檢測(cè)器是由于該檢測(cè)器能夠從亞硝胺生成NO，NO又能與臭氧進(jìn)行特異性的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)特異性的亞硝胺檢測(cè)。而如今，隨著對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度的要求不斷增加，TEA 的檢出限及其復(fù)雜的操作程序，已無(wú)法滿足目前的低檢出限和高樣品通量要求。質(zhì)譜儀已在不斷取代TEA。

 

由Munch 和 Bassett 于2004 年建立的EPA 方法521 提供了一個(gè)適應(yīng)當(dāng)時(shí)要求的、基于化學(xué)電離（CI）和帶有內(nèi)部離子化功能的離子阱質(zhì)譜儀的氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，而不是標(biāo)準(zhǔn)的帶有外部離子源的四極桿或離子阱質(zhì)譜儀。如今隨著技術(shù)的發(fā)展，GC-MS 三重四極桿也可以在低分子量區(qū)域提供高靈敏度和高選擇性的分析，使得非常低濃度的亞硝胺檢測(cè)，甚至是在復(fù)雜樣品中的低濃度檢測(cè)，成為可能。這一可能性源于使用更為簡(jiǎn)便的、利用常規(guī)的電子轟擊源（EI）的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，來(lái)建立低濃度亞硝胺檢測(cè)的便捷方法。

 

本應(yīng)用說(shuō)明文章描述了一套完整的、使用 GC-MS/MS 進(jìn)行食品中亞硝胺類化合物常規(guī)檢測(cè)和定量的方法。本工作中的食品基質(zhì)包括多種不同的麥芽啤酒產(chǎn)品以及作為最終食品產(chǎn)物銷售的啤酒本身。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，我們特別注意優(yōu)化，以在達(dá)到對(duì)亞硝胺化合物檢測(cè)所需的高靈敏度的同時(shí)，提供一種迅速、易于實(shí)現(xiàn)的常規(guī)檢測(cè)方法。

 

樣品處理方法基于AOAC 官方方法 (2000), 982.11 并略有改動(dòng)。我們建立了一種使用Celite 硅藻土柱并用DCM 洗脫的固相萃取方法來(lái)從啤酒樣品中分離亞硝胺。

 

GC-MS/MS 儀器

 

 

我們使用了Thermo Scientific TSQTM 8000 GC-MS/MS 軟件套件中的AutoSRM 軟件進(jìn)行了三重四極桿質(zhì)譜方法的建立，且并未對(duì)AutoSRM 生成的方法進(jìn)行任何手動(dòng)修改。一個(gè)裝有待分析亞硝胺化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶專供AutoSRM 程序使用。

 

AutoSRM 程序自動(dòng)進(jìn)行以下三個(gè)步驟：

1. 首先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全掃描分析（圖1.）。從全掃中得到的信號(hào)最強(qiáng)的離子將被作為一級(jí)離子。

2. 對(duì)上一步確定的一級(jí)離子（母離子）進(jìn)行二級(jí)離子（子離子）譜圖獲取（可以根據(jù)分析需求設(shè)定一級(jí)離子的個(gè)數(shù)）。找出每個(gè)一級(jí)離子產(chǎn)生的信號(hào)最強(qiáng)的二級(jí)離子（可以手動(dòng)選擇最感興趣的一級(jí)離子進(jìn)行進(jìn)

一步優(yōu)化）。

 

 

表1. AutoSRM 生成的SRM 方法設(shè)置

 

3. 對(duì)所有化合物的選定的母離子/ 子離子對(duì)進(jìn)行碰撞能的優(yōu)化，以獲得最大化合物響應(yīng)及最佳方法靈敏度（圖2）。

 

AutoSRM 程序能夠根據(jù)需要從一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品樣品瓶啟動(dòng)，完成所需的進(jìn)樣次數(shù)。

 

表1 就是由AutoSRM 自動(dòng)生成的SRM 離子對(duì)表格。該表同時(shí)還顯示了TSQ8000 GC-MS/MS 在Timed-SRM 模式下、在化合物洗脫時(shí)間左右用一個(gè)60 秒的短采集窗口進(jìn)行采集的SRM 采集方法。無(wú)需對(duì)掃描時(shí)段進(jìn)行任何其他的設(shè)置，或者說(shuō)如果需要在某化合物的洗脫時(shí)間之外對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，則需要手動(dòng)添加該化合物。

 

在大量各種可能的亞硝胺化合物之中，本方法涵蓋了那些被報(bào)道與發(fā)芽麥芽干燥的過(guò)程相關(guān)的亞硝胺化合物。被分析的樣品包括未添加標(biāo)樣的麥芽啤酒樣品，以及作為空白樣的4％乙醇。如需對(duì)其他食物基質(zhì)進(jìn)行分析，其它化合物可以隨時(shí)參照前述AutoSRM 方法建立的步驟添加至本方法中。

 

本方法中包含的亞硝胺類化合物的色譜呈現(xiàn)了較快的流出，從7.87 的NDMA 到12.47 分，能夠?qū)崿F(xiàn)較短的循環(huán)時(shí)間并提高樣品通量。圖3 顯示了用校準(zhǔn)曲線中的最低濃度--1 ppb 的樣品得到的峰強(qiáng)度。從圖中可見(jiàn)NDMA 檢測(cè)的信噪比依然很好。

 

 

圖1. AutoSRM 對(duì)NDMA 從EI 全掃譜圖中進(jìn)行一級(jí)離子選擇

 

 

圖2. AutoSRM 對(duì)所有亞硝胺一級(jí)離子進(jìn)行碰撞能優(yōu)化

 

圖 3. 濃度為1ppb 的標(biāo)準(zhǔn)品混合物的色譜圖

 

我們?cè)? ppb 到500 ppb 這一較寬的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行了定量校準(zhǔn)。圖4 展示了從所有的校準(zhǔn)檢測(cè)中得到的亞硝胺色譜峰。在所有情況下，NDMA 的峰形都是完全對(duì)稱的，沒(méi)有拖尾，而且無(wú)需任何手動(dòng)修正就得到了非�？煽康姆迕娣e積分值。圖5 所示為用于樣品定量的NDMA 校準(zhǔn)曲線，曲線R2 大于0.99，可見(jiàn)線性極佳。本TSQ 8000 GCMS/MS 方法對(duì)所有亞硝胺都達(dá)到了相同水平的校準(zhǔn)精度。

 

圖 4. NDMA 從1 ppb ( 底部) 至 500 ppb ( 頂部) 的校準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

 

圖 5. NMDA 從1 ppb 到500 ppb 的校準(zhǔn)曲線

 

最低定量限（LOQ）和最低檢出限（LOD）的計(jì)算都基于色譜峰的信噪比。LOQ 的計(jì)算基于的信噪比為10，LOD 基于的信噪比為3。

 

表2. 本方法LOQ 和LOD 的計(jì)算

 

化合物確認(rèn)是通過(guò)Thermo Scientific TraceFinderTM 定量分析軟件提供的離子比檢查功能實(shí)現(xiàn)的，該功能比較了用于定量的SRM 與定性SRM 的離子強(qiáng)度。覆蓋1 ppb 到500ppb 濃度區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)品被進(jìn)行了三次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)并用于計(jì)算離子比的精確度，結(jié)果顯示在表3 中。雖然所有被檢測(cè)的離子都處于低質(zhì)量數(shù)范圍并可能受到多種干擾，二級(jí)離子的離子比的精確度一直很好的保持在1-4%。

 

為了在樣本分析中進(jìn)行質(zhì)量控制，在用TraceFinder 軟件進(jìn)行定量數(shù)據(jù)處理時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果都會(huì)通過(guò)離子比檢查進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)所有化合物來(lái)說(shuō)，采集的兩個(gè)二級(jí)離子的離子比例需保持在± 5%（10%） 范圍內(nèi)，符合從標(biāo)準(zhǔn)品得到的校準(zhǔn)值。這為常規(guī)的樣品檢測(cè)提供了堅(jiān)實(shí)的安全保障。表3 列出了所有本研究中涉及到的亞硝胺的平均離子比值。

 

我們對(duì)多種樣品進(jìn)行了檢測(cè)，包括空白樣和添加了標(biāo)準(zhǔn)品的啤酒樣品等。空白樣的檢測(cè)結(jié)果如表4 所示。該樣品中檢出的低濃度NDMA經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)低于校正曲線濃度，也低于LOQ。故在此LOQ 下，空白樣品可以被確認(rèn)為不含亞硝胺化合物。

 

另一個(gè)樣品通過(guò)在啤酒中添加不同濃度的亞硝胺制備而成。所有的亞硝胺化合物都被檢出，并在低濃度區(qū)間進(jìn)行了定量，如表5 所示。每個(gè)用于定量的峰都通過(guò)了離子比質(zhì)量控制，并且能夠在這樣的低濃度通過(guò)計(jì)算離子比對(duì)每個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性的化合物進(jìn)行確認(rèn)。

 

通過(guò)本文描述的基于TSQ 8000 系統(tǒng)的GC-MS/MS 方法，所有研究涉及的亞硝胺化合物都能在食品安全控制所要求的低濃度被安全地檢出并實(shí)現(xiàn)精確的定量。在定量校正曲線所用的最低濃度為1 ppb 的情況下，所有化合物的LOD 都低于1 ppb。TSQ 8000 GC-MS/MS 在1-500 ppb 的范圍內(nèi)顯示出寬廣的線性區(qū)間和優(yōu)異的準(zhǔn)確度。所有校正曲線的線性都非常好，R2 大于0.99。

 

TSQ 8000 GC-MS/MS 也顯示出非常好的離子比穩(wěn)定性，適用于陽(yáng)性樣品的確認(rèn)。所有化合物的離子比，哪怕是在LOQ 濃度下，RSD% 都低于4%。基于GC-MS/MS 的亞硝胺檢測(cè)方法的使用、建立，以及維護(hù)都很簡(jiǎn)單。哪怕是在分析新的未知物時(shí)，我們獨(dú)有的AutoSRM 軟件也能夠自動(dòng)找出并優(yōu)化SRM 離子對(duì)和碰撞能。

 

基于本文所示的GC-MS/MS 方法，TSQ 8000 GC-MS/MS 能夠準(zhǔn)確可靠地測(cè)出真實(shí)樣品中的亞硝胺含量。

 

本文所述的利用TSQ 8000 GC-MS/MS 進(jìn)行食品中的亞硝胺檢測(cè)的GC-MS/MS 方法可以直接用于常規(guī)的食品安全控制。本方法使用的標(biāo)準(zhǔn)GC-MS/MS 三重四極桿儀器也被廣泛應(yīng)用于常規(guī)食品安全控制的其他領(lǐng)域，例如殺蟲(chóng)劑、POPs，或多環(huán)芳烴。本方法檢測(cè)迅速，能夠支持高樣品通量，并且提供的結(jié)果具有非常高的靈敏度和精確度。本方法使用常規(guī)的電子轟擊源進(jìn)行離子化并實(shí)現(xiàn)低濃度的亞硝胺定量，我們推薦將本方法作為前述使用液態(tài)CI試劑的化學(xué)離子化的離子阱方法的高產(chǎn)出的替代方案。

 

 

[1] Robert K. Boyd, Cecilia Basic, Robert A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, 2008 John Wiley& Sons, Ltd.

[2] Material Safety Data Sheet NDMA.

[3] Agency for Toxic Substances & Disease Registry, Public Health Statement for n-nitrosodimethylamine, 1989, http://www.atsdr. cdc.gov/toxprofiles/phs141. html

[4] Richard A. Scanlan, Nitrosamines and Cancer, Linus Pauling institute, http://lpi.oregonstate.edu/f-w00/nitrosamine.html .

[5] Mario M. Mangino and Richard A. Scanlan, N-Nitrosamines in Beer, N-Nitroso Compounds, ACS Symposium Series, Vol. 174,1981, Chapter 17, 229–245.

[6] Munch, J.W., Bassett, M.V. Method 521: Determination of nitrosamines in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography with large volume injection and chemical ionization tandem mass spectrometry (MS/MS) (Version 1.0) U.S. Environmental Protection Agency.

[7] Raymond E. March, Richard J. Hughes, Quadrupole Storage Mass Spectrometry, 2nd Ed., John Wiley & Sons 1989.

[8] AOAC Official Method 982.11, 2000.

[9] Introducing AutoSRM, Thermo Fisher Scientific, Technical Brief No. AB52298, 2012.

[10] Thermo Scientific TSQ 8000 Triple Quadrupole GC-MS/MS Instrument Method, Thermo Fisher Scientific, Technical Brief No. AB52299, 2012.