Q Exactive Focus 不同高分辨定量方式在藥物分析中的應(yīng)用

儀器： Thermo Q Exactive Focus 四極桿 - 靜電場(chǎng)軌道阱高分辨串聯(lián)質(zhì)譜
離子源參數(shù)： HESI Spray voltage: +3.5 KV; Sheath Gas Pressure: 40 arb; Aux Gas Pressure: 10 arb; Capillary Temp:300℃ ; Heater Temp: 350℃

2.3 樣品制備

取鹽酸美金剛片雜質(zhì) N-（二甲基金剛烷）甘氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋后制成含 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸 0.12、 0.6、1.2、 6.0、 12.0、 60、 120、 600、 1200、 6000、 12000 ng/ml（ppb）的溶液，分別按上述不同掃描模式進(jìn)樣分析。

3. 結(jié)果

3.1 全掃描（FullScan）

全掃描 FullScan 定量記錄的是所有進(jìn)入檢測(cè)器的離子信號(hào)，然后通過精確分子量提取獲得目標(biāo)化合物質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量。圖 4 為 0.6、 1.2、 6.0 ng/ml 三個(gè)濃度全掃描下目標(biāo)化合物的提取離子流信號(hào)，即使在 0.6 ng/ml 濃度下，上樣量?jī)H為 0.6 pg，全掃描仍能檢測(cè)到目標(biāo)化合物離子明顯的信號(hào)， 1.2 ng/ml 濃度下信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)一步提高，且提取離子流窗口都使用了統(tǒng)一的5 ppm（0.0012 amu），表明 QE Focus 在極低濃度下可以保持出色的質(zhì)量精度。

考察全掃描定量的線性范圍和重現(xiàn)性。 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的一級(jí)全掃描精確質(zhì)量數(shù) XIC 色譜圖， 1.2 ng/ml~12 µg/ml 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 5， 1.2 ng/ml 和 120 ng/ml 兩個(gè)濃度下各 5 針精密度見圖 6。

圖 6. 全掃描定量精密度（1.2、 120 ng/ml）

結(jié)果表明， N-（二甲基金剛烷）甘氨酸在 1.2 ng/ml~12 µg/ml 線性關(guān)系良好， Y=-138720+362674X-1.44506X2， R2=1.0000，各濃度點(diǎn)的偏差都在 5% 以內(nèi)。在 1.2 ng/ml 定量下限和 120 ng/ml 高濃度下重現(xiàn)性均良好， 5 針 RSD 均小于 4%

3.2 選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）

選擇離子監(jiān)測(cè) SIM 高分辨定量通過四極桿對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性通過，然后將目標(biāo)化合物送入 Orbitrap 進(jìn)行高分辨掃描。通過四極桿的篩選和過濾，可去除大量的干擾離子，使目標(biāo)化合物更多的進(jìn)入檢測(cè)器，然后通過一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)的提取進(jìn)行定量。比較 0.12 ng/ml SIM 模式下提取離子流信號(hào) , 結(jié)合 AGC 值和各濃度下離子注入時(shí)間 , 可知在 0.12 ng/ml 濃度下進(jìn)入 Orbitrap 檢測(cè)器的目標(biāo)化合物離子數(shù)目大幅增加。即使?jié)舛缺热珤呙杞档?10 倍，仍可獲得較好的峰型。

但在定量過程中，常存在同質(zhì)異素甚至同分異構(gòu)體的干擾，通過一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)無法獲得與目標(biāo)化合物的有效區(qū)分，例如在 SIM 模式下各濃度 XIC，可觀察到 6.2 min 存在干擾峰（圖7 藍(lán)色虛線框部分）。

圖 7. 選擇離子監(jiān)測(cè) 0.6 PPb、 1.2 PPb、 6.0 PPb 濃度下提取離子流色譜圖

從圖 8 一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中可以看出， 6.2 min 的峰中存在m/z238.014 的干擾離子，與目標(biāo)雜質(zhì) N-（二甲基金剛烷）甘氨酸非常接近，僅相差 0.5 ppm，無法通過一級(jí)質(zhì)譜對(duì)兩者加以區(qū)分。

圖 8. N-（二甲基金剛烷）甘氨酸和干擾峰一級(jí)質(zhì)譜比對(duì)

3.3 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）

平行反應(yīng)檢測(cè)（PRM）高分辨定量通過四極桿對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性通過，

離子在通過后立即進(jìn)入碰撞池并發(fā)生高能碰撞碎裂，所產(chǎn)生的碎片將被同時(shí)送入 Orbitrap 進(jìn)行高分辨掃描，然后選擇高分辨的二級(jí)子離子進(jìn)行定量。該定量方法的特點(diǎn)為，在四極桿過濾掉大量干擾離子提高了靈敏度的同時(shí)，二級(jí)高分辨質(zhì)譜進(jìn)一步提高了定量的專屬性。

為更好的進(jìn)行PRM定量，需要選擇出高質(zhì)量的定量子離子，采用 Q Exactive Focus 對(duì)目標(biāo)雜質(zhì) N-（二甲基金剛烷）甘氨酸進(jìn)行二級(jí)碎裂，在獲得了高質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜圖后，將其導(dǎo)入專業(yè)的小分子結(jié)構(gòu)解析軟件 Mass Frontier 7.0，可快速準(zhǔn)確的完成對(duì)不同碎片離子及其所對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行自動(dòng)推測(cè)（圖 9）。

圖 9. Mass Frontier 自動(dòng)歸屬二級(jí)質(zhì)譜碎片

該軟件含有 Fragmentation Library 碎裂數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)幾乎涵蓋了所有已發(fā)表的文獻(xiàn)，在快速完成碎片結(jié)構(gòu)歸屬的同時(shí)，可以獲得完整的碎片裂解機(jī)理，并可方便的調(diào)用查看所引用的文獻(xiàn)情況，保證了碎片解析的準(zhǔn)確性（圖 10）。

圖 10. Fragmentation Library 提供碎片裂解機(jī)理

由以上分析可知， m/z 107.0855 和 163.1481 的碎片具有較高的質(zhì)量，作為 PRM 定量的首選離子。

進(jìn)一步，通過比對(duì) N-（二甲基金剛烷）甘氨酸二級(jí)質(zhì)譜和6.2 min 干擾離子的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖 11）發(fā)現(xiàn)， m/z 107.0855 碎片離子同時(shí)存在于兩者之中（藍(lán)色虛線框部分），以此離子定量無法有效區(qū)分目標(biāo)化合物和干擾離子，而m/z 163.1481 碎片離子只存在于目標(biāo)化合物二級(jí)質(zhì)譜圖中（紅色虛線框部分），以此離子定量，具有更高的專屬性。

圖 11. N-（二甲基金剛烷）甘氨酸和干擾峰二級(jí)質(zhì)譜比對(duì)

通過比對(duì) SIM 定量和 PRM 定量效果，通過采用子離子m/z 163.1481 進(jìn)行 PRM 定量，可更好的去除背景干擾，獲得更高的專屬性（圖 12）。

圖 12. 不同定量方式和不同的子離子選擇情況下提取離子流比對(duì)