高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中的雙氰胺

 

周 亮

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

雙氰胺又名二氰二氨，縮寫(xiě)DICY 或DCD。是氰胺的二聚體，也是胍的氰基衍生物。白色結(jié)晶粉末，可溶于水、醇、乙二醇和二甲基甲酰胺，幾乎不溶于醚和苯。干燥時(shí)穩(wěn)定。雙氰胺化肥，雙氰胺復(fù)合肥料可控制硝化菌的活動(dòng)，使氮肥在土壤中的轉(zhuǎn)化速度得到調(diào)節(jié)，減少氮的損失，提高肥料的使用效率。農(nóng)民普遍會(huì)在牧場(chǎng)使用雙氰胺，目的是防止硝酸鹽等對(duì)人體有害的肥料副產(chǎn)品流入河流或湖泊。新西蘭的奶牛養(yǎng)殖是采取放養(yǎng)的方式，如果草木干旱，奶農(nóng)往往會(huì)使用一些肥料增強(qiáng)草木的抗旱性以及肥力，這就造成了污染。而由于新西蘭國(guó)內(nèi)注重環(huán)保，因此使用雙氰胺對(duì)草木中的有害物質(zhì)進(jìn)行中和，這就導(dǎo)致了殘留的藥品流入奶牛體內(nèi)，造成奶品的污染。2013年1 月25 日，新西蘭牛奶中發(fā)現(xiàn)了有害物質(zhì)—雙氰胺。雖然國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)食品中的雙氰胺限量，但高劑量的雙氰胺對(duì)人體是有毒的。

 

奶粉中雙氰胺的LCMSMS 檢測(cè)的難點(diǎn)在于：首先雙氰胺本身的分子量很小，極性很大，一般的C18 柱保留不住，其次嬰幼兒奶粉的基質(zhì)非常復(fù)雜，含有大量糖類(lèi)和蛋白質(zhì)，必須有合適的前處理方法以獲得更好的凈化效果。本實(shí)驗(yàn)選用Thermo Scientific Syncronis HILIC色譜柱配合Hypercarb 凈化柱，建立了雙氰胺LCMSMS的檢測(cè)方法，結(jié)果顯示該方法具有靈敏度高，重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)。

 

TSQ Quantum Ultra 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific 公司），配置有電噴霧電離源（ESI）；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高壓液相色譜

 

標(biāo)準(zhǔn)品：雙氰胺純度大于98％，內(nèi)標(biāo)雙氰胺-15N4 純度為95％。用乙腈溶解并配制成1.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)含量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。其他試劑均為HPLC 色譜純。

 

表1. 液相梯度

 

時(shí)間/min	水(含0.5mM NH4Ac, pH=4.0)	乙腈	流速/μL/min
0.00	5	95	300
4.00	5	95	300
4.50	50	50	300
8.50	50	50	300
8.60	5	95	300
15.00	5	95	300

 

色譜柱：Syncronis HILIC，100mm×2.1mm，5μm；

梯度洗脫程序見(jiàn)表1，其中A 為0.5mM NH4Ac（pH=4.0）水溶液，B 為乙腈。進(jìn)樣量10μL.

 

電噴霧電離源（ESI），正離子模式；選擇反應(yīng)監(jiān)控（SRM）掃描模式，噴霧電壓：3000V；氣化器溫度350℃，離子傳輸管溫度：350℃；氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，其中鞘氣為30arb, 輔助氣為8arb，氬氣用作碰撞氣, 碰撞壓力為1.5mTorr; 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM），離子對(duì)見(jiàn)表2。

 

表2. 化合物離子對(duì)信息

 

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，雙氰胺的LOD 為0.25ng.mL-1，信噪比為20，提取離子流圖見(jiàn)圖1。

 

 

圖1. 雙氰胺最低檢測(cè)限圖

 

采用上述儀器方法進(jìn)行測(cè)定， 雙氰胺在0.5ng.mL-1-100ng.mL-1 呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性相關(guān)性，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9998， 濃度水平分別為：0.5ng.mL-1、1ng.mL-1、5ng.mL-1、10 ng.mL-1、50ng.mL-1、 100ng.mL-1，內(nèi)標(biāo)雙氰胺-15N4濃度為5ng.mL-1，線(xiàn)性方程見(jiàn)圖2。

 

 

圖2. 線(xiàn)性方程圖

 

對(duì)1ng.mL-1 的雙氰胺，采用上述儀器方法，連續(xù)進(jìn)樣7針，計(jì)算RSD 值。結(jié)果為1.19%，離子流圖如圖3。

 

 

圖3. 平行進(jìn)樣7 針的色譜圖

 

取某市售嬰幼兒奶粉試樣，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。奶粉的前處理方法如下：稱(chēng)奶粉基質(zhì)樣品2.000g，加10mL 1% 的甲酸/ 水提取液，渦旋震蕩提取5min，超聲萃取10min；冷凍離心機(jī)6000R/min，離心10min，取上清液5mL 到小離心管中，14000R/min 離心10min，上清液全部過(guò)凈化柱（3cc,200mg/Hypercarb），控制流速1mL/min，用10mL 超純水清洗柱子；用甲醇/ 乙腈（4/6）洗脫，接取洗脫液氮?dú)獯蹈桑?0℃），用1mL（乙腈/ 水，9 : 1）定容，0.22 微米有機(jī)濾膜過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明，空白基質(zhì)在雙氰胺及內(nèi)標(biāo)雙氰胺-15N4 的出峰位置沒(méi)有干擾，添加5ng.mL-1 的色譜圖如圖4，該圖中上方為基質(zhì)添加，下方為基質(zhì)空白。

 

 

圖4. 基質(zhì)添加及空白基質(zhì)色譜圖

 

TSQ Quantum Ultra 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)奶粉中雙氰胺具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)定量限可以做到0.25ng.mL-1。并且該方法具有良好的線(xiàn)性范圍與精密度， 在0.5ng.mL-1-100ng.mL-1 的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9998，重復(fù)進(jìn)樣7 針1ng.mL-1 的雙氰胺的RSD 值為1.19%。使用Hypercarb 凈化柱能很好的處理奶粉樣品，空白基質(zhì)沒(méi)有干擾，證明該方法檢測(cè)雙氰胺具有很好的適用性。