基于Q Exactive-GC建立高分辨精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫及目標(biāo)化合物篩查流程

彭興，朱曼潔   賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

摘 要
本研究基于氣相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（Thermo Scientific TM Q Exactive-GC），并結(jié)合相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件，研究精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫建立以及利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行目標(biāo)化合物快速篩查的流程。實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，均在60,000 FWHM（200m/z）及以上的分辨率下采集，且數(shù)據(jù)的質(zhì)量準(zhǔn)確度保證在2ppm范圍內(nèi)，所以，其超高的性能特點(diǎn)保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性�？焖俸Y查方法同時(shí)對(duì)精確質(zhì)量數(shù)偏差、保留時(shí)間窗口、同位素分布與同位素豐度信息等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最大程度的降低假陽性以及假陰性結(jié)果的干擾，從而獲得最準(zhǔn)確的篩查結(jié)果。

關(guān)鍵詞 Q Exactive-GC；高分辨精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫；目標(biāo)化合物篩查

1.引言
隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、司法等領(lǐng)域，對(duì)于快速篩查方法的需求越來越迫切。少量化合物檢測(cè)以及大量特定目標(biāo)性化合物的篩查方法已無法滿足高通量、快速篩查的要求。三重四極桿作為常見的檢測(cè)手段，一般采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描模式，由于其需要固定目標(biāo)化合物的數(shù)據(jù)庫，所以其對(duì)于高通量快速篩查方面仍有一定的局限性。高分辨質(zhì)譜由于其分析速度快、質(zhì)量精度高和分辨率高等特點(diǎn)，使其在快速篩查方面具有較大的優(yōu)勢(shì)。但是常規(guī)的高分辨質(zhì)譜如飛行時(shí)間質(zhì)譜又通常受限于靈敏度低、定量范圍窄以及穩(wěn)定性不好等方面的問題，無法真正滿足用戶的需求。
靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap）在具備常規(guī)高分辨質(zhì)譜特性的同時(shí)，其分辨率更高，質(zhì)量穩(wěn)定性更強(qiáng)，同時(shí)具有高靈敏度，滿足痕量檢測(cè)需求；具有寬的動(dòng)態(tài)定量范圍，利于低濃度和高濃度化合物的同時(shí)定量；儀器穩(wěn)定性高，可保證長(zhǎng)期檢測(cè)的可靠性。
Q Exactive-GC 采用先進(jìn)的靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap）檢測(cè)技術(shù)，分辨率高達(dá) 120,000 FWHM（200  m/z ），同時(shí)保持良好的靈敏度。Q Exactive-GC 可進(jìn)行高分辨數(shù)據(jù)全掃描采集，同時(shí)保證了數(shù)據(jù)的可溯源性，最大限度地對(duì)樣品特性進(jìn)行相關(guān)挖掘，分析。利用 Q Exactive-GC 進(jìn)行目標(biāo)化合物快速篩查，通常需要結(jié)合相關(guān)的高分辨精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫。當(dāng)分辨率高于 50,000 FWHM（200  m/z ）時(shí)，高分辨全掃描方式的選擇性會(huì)優(yōu)于三重四極桿質(zhì)譜 MRM 的掃描模式，即交叉點(diǎn) [1] 。因此，Q Exactive GC 高分辨質(zhì)譜參數(shù)選擇了 60,000 到 120,000（200  m/z ）的分辨率進(jìn)行目標(biāo)化合物快速篩查。
本研究基于 Thermo Fisher Scientific 最新氣質(zhì)高分辨產(chǎn)品Q Exactive-GC，探索了精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫建立以及結(jié)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩查的相關(guān)流程。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1 質(zhì)譜條件
儀器型號(hào)：Thermo Scientific TM Q Exactive-GC 質(zhì)譜儀
離子化類型：EI（電子轟擊）
離子源溫度：280 ℃
電子能量：70 eV
采集模式：高分辨全掃描（FullScan）
質(zhì)量分辨率：60,000 FWHM（200  m/z ）；120,000
FWHM（200  m/z ）
掃描范圍：50-700  m/z

2.2 數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)庫建立流程
1) 配置化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為 2.0 mg/L（溶劑正己烷）；
2) 全掃描模式進(jìn)樣分析，分辨率 60,000 FWHM（200  m/z ）
或 120,000 FWHM（200  m/z ）；
3) 數(shù)據(jù)文件經(jīng)解卷積軟件處理；
4) 獲得各個(gè)化合物離子碎片理論精確質(zhì)量；
5) 編入數(shù)據(jù)庫。

3.實(shí)驗(yàn)與結(jié)果
3.1 數(shù)據(jù)文件處理
數(shù)據(jù)文件采用新一代解卷積軟件進(jìn)行處理。經(jīng)解卷積后，可從多個(gè)疊加圖譜中快速分離、提取單一化合物譜圖信息，去除干擾及背景離子，從而獲得相對(duì)純凈的質(zhì)譜圖。同時(shí)，解卷積軟件還可結(jié)合 NIST 譜庫進(jìn)行離子匹配及碎片離子理論質(zhì)量數(shù)計(jì)算，得到更加準(zhǔn)確的定性信息。
解卷積及譜庫檢索流程主要包括：① 數(shù)據(jù)文件解卷積；② 計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)；③ 譜庫檢索。如圖 1 所示。

3.2 數(shù)據(jù)庫建立
Q Exactive-GC 采用電子轟擊（EI）離子源，其電離效率高，可將化合物打碎產(chǎn)生多個(gè)碎片離子，提供了豐富的譜圖信息。Q Exactive-GC 采用全掃描采集模式，結(jié)合自身高分辨率及高質(zhì)量精度，獲得的數(shù)據(jù)更為精確、可靠。在建立 Database 時(shí)，通常選取響應(yīng)較高的碎片離子作為定量離子和定性離子。
EI 質(zhì)譜圖可提供豐富了譜圖信息。建立 Database 時(shí)，通常選取 2-5 個(gè)碎片離子錄入數(shù)據(jù)庫。以基峰離子做為定量離子，其余的離子為定性離子。同時(shí)提供了基峰離子的化學(xué)式，軟件可根據(jù)化學(xué)式自動(dòng)進(jìn)行同位素?cái)M合，對(duì)比各個(gè)同位素的精確質(zhì)量數(shù)及豐度，提供更為確切的篩查信息。Database 主要包含化合物名稱、CAS 登記號(hào)、碎片離子信息（精確質(zhì)量、化學(xué)式）、保留時(shí)間等信息。
按照歐盟方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜方法必須達(dá)到 4 個(gè)定性點(diǎn)的確證要求 [2] ，對(duì)于三重四極桿串接質(zhì)譜，通常只檢測(cè) 2 對(duì)離子對(duì)，因此其定性點(diǎn)往往只有 4-5 個(gè)；而對(duì)于高分辨質(zhì)譜，由于其對(duì)精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行全掃描測(cè)定，因此其每個(gè)離子被定義為 2 個(gè)定性點(diǎn)，相對(duì)豐度在基峰強(qiáng)度 10% 以上的離子均可作為定性離子。
按照以上規(guī)則，Q Exactive-GC 所采集數(shù)據(jù)的定性點(diǎn)均在 4 個(gè)以上，并可以實(shí)現(xiàn)全掃描圖譜的庫檢索工作。利用 TraceFinder 3.3可快速建立精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫（Database），并且可利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)檢索。數(shù)據(jù)庫如圖 2 所示。

3.3 快速篩查流程
3.3.1 目標(biāo)化合物篩查流程
利用 Q Exactive-GC 高分辨率、高質(zhì)量精度、高靈敏度等優(yōu)異性能，結(jié)合高分辨精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫進(jìn)行快速篩查，不受目標(biāo)化合物數(shù)量的限制，從而達(dá)到高通量、快速篩查的目的，并滿足低濃度化合物檢測(cè)和數(shù)據(jù)回溯性研究。
利用化合物的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和保留時(shí)間，同時(shí)結(jié)合同位素強(qiáng)度、同位素分布等信息，建立了目標(biāo)化合物篩查流程。如圖 3 所示。

3.3.2 篩查參數(shù)設(shè)置
Q Exactive-GC 篩查方法主要涉及精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫的選擇、保留時(shí)間參數(shù)設(shè)置、精確質(zhì)量數(shù)據(jù)參數(shù)設(shè)計(jì)、同位素模型參數(shù)設(shè)置等方面。通過參數(shù)的設(shè)置，達(dá)到快速、準(zhǔn)確篩查的目的，如圖 4 所示。


采用固定的色譜柱、氣相色譜方法，可以保證化合物統(tǒng)一的保留時(shí)間。通過保留時(shí)間的限制，盡可能的將化合物在色譜上進(jìn)行分離，再結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫可達(dá)到更可靠的篩查效果。
Q Exactive-GC 超高分辨率以及高質(zhì)量精度，使測(cè)定的數(shù)據(jù)可信度更高。在篩查過程中，準(zhǔn)確、穩(wěn)定的數(shù)據(jù)保證了篩查結(jié)果的確定性、唯一性。實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)400余種農(nóng)藥化合物選取的1345個(gè)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)的研究，其實(shí)測(cè)值與理論值的質(zhì)量偏差均在1ppm范圍內(nèi)[3]，如圖4所示。Q Exactive-GC在大量的數(shù)據(jù)采集過程中能保持良好的質(zhì)量偏差，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了通過盡可能低地限制質(zhì)量偏差以減少假陽性結(jié)果。

除了保留時(shí)間、精確質(zhì)量、質(zhì)量偏差等標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，目標(biāo)化合物篩查流程還引入了同位素?cái)M合的概念，將實(shí)際值和理論同位素值進(jìn)行對(duì)比，增加、完善了判斷條件。這主要是因?yàn)榛�合物具備的同位素簇信息�?duì)于定性具有重要意義。例如 Cl 和 Br，其同位素貢獻(xiàn)占到了 32.0% 和 97.3%，并且隨著化合物中元素個(gè)數(shù)的增加，同位素貢獻(xiàn)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。
TraceFinder 3.3 可根據(jù)離子的化學(xué)式自動(dòng)生成相應(yīng)的同位素峰理論信息，自動(dòng)與測(cè)定值相比較�；�合物的同位素分布與同位素豐度信息在檢索中的得分作為篩查的一項(xiàng)重要參數(shù)和判斷依據(jù)。如圖 5 所示。


3.5 篩查結(jié)果瀏覽及導(dǎo)出報(bào)告
TraceFinder 3.3 篩查結(jié)果的瀏覽采用了簡(jiǎn)單、直觀的“交通信號(hào)燈”模式，結(jié)果展示更清楚直觀。如圖 8 所示，符合篩查結(jié)果中參數(shù)設(shè)置的項(xiàng)目可清晰顯示，便于使用者查看。


同時(shí)，篩查結(jié)果可快速轉(zhuǎn)化成常見數(shù)據(jù)格式（XLS, PDF, CSV 等）快速預(yù)覽、生成、導(dǎo)出。用戶也可根據(jù)不同的檢測(cè)需要選擇默認(rèn)模板和自定義報(bào)告模板，快速生成相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.結(jié)論
目標(biāo)化合物篩查是 Q Exactive-GC 在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒物檢測(cè)等領(lǐng)域的主要應(yīng)用。利用儀器超高分辨率、穩(wěn)定的質(zhì)量精度以及高靈敏度與 TraceFinder 軟件結(jié)合，可以快速建立化合物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，利用化合物的精確質(zhì)量數(shù)與保留時(shí)間，同位素強(qiáng)度，同位素分布等信息結(jié)合，對(duì)樣品進(jìn)行快速篩查。

參考文獻(xiàn)
[1]. Comprehensive comparison of liquid chromatography selectivity as provided by two types of liquid chromatography detectors (high resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry): “Where is the crossover point?” A.Kaufmann et al. / Analytica Chimica Acta 673 (2010) 60-72
[2]. 《EC 657-2002》
[3]. 彭興，朱曼潔，李春麗，蘆苓. 基于 Q Exactive-GC 精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫篩查及確證食品中 435 種農(nóng)藥多殘留. 賽默飛世爾科技.