基于Q Exactive-GC精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫篩查及確證食品中435種農(nóng)藥多殘留
彭興 1 ，朱曼潔 1 ，李春麗 1 ，蘆苓 2
1. 賽默飛世爾科技（中國）有限公司 ；2.Thermo Fisher Scientifc, Liverpool, UK
摘 要
本研究利用氣相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（Thermo Scientific TM Q Exactive-GC）建立了435種農(nóng)藥
化合物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件，在此基礎(chǔ)上建立了農(nóng)藥多殘留快速篩查流程。實驗對檢索中所
需的各項參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，用以提高篩查準(zhǔn)確度，避免假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。實驗結(jié)果表明，在實際樣品檢
測中，分辨率60,000 FWHM（200 m/z）及以上， 質(zhì)量準(zhǔn)確度 < 2.0 ppm，篩查準(zhǔn)確度會有大大改善。同時仍然可以保
持高靈敏度，完全滿足食品中農(nóng)藥殘留檢測要求。篩查方法同時使用了精確質(zhì)量數(shù)和偏差，保留時間窗口，同位素分布與同位素豐度信息等參數(shù)，進(jìn)而獲得快速、準(zhǔn)確的結(jié)果。
關(guān)鍵詞 Q Exactive-GC；精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫；農(nóng)藥多殘留
1.引言
農(nóng)產(chǎn)品作為人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚氖称�，其日常消費量和市場需求量巨大，目前，全球有超過 1100 種農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1] 。為提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，改善其品質(zhì)，施用農(nóng)藥不可避免，加之農(nóng)藥的濫用及亂用現(xiàn)象，這不僅使得果蔬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，并且加重了農(nóng)藥對環(huán)境的污染，同時對國際貿(mào)易及消費者的健康造成不良影響。為了應(yīng)對這次問題，許多國家和國際組織都發(fā)布了農(nóng)藥的最大殘留限量（MRLs），對不同基質(zhì)中的不同農(nóng)藥殘留進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定[2]。我國GB2763-2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》也規(guī)定了387種農(nóng)藥的3650項MRLs（GB 2763-2014）[3]。果蔬中農(nóng)藥殘留問題，不僅成為食品安全領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，而且也制約了我國果蔬產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易。
農(nóng)藥的痕量多殘留檢測，一直是農(nóng)藥殘留分析的研究重點和發(fā)展趨勢，是分析化學(xué)工作者追求的目標(biāo)。目前，全世界在用農(nóng)藥加之其代謝物、同分異構(gòu)體和降解產(chǎn)物可達(dá)幾千種，這就決定了農(nóng)藥分析的復(fù)雜性和多樣性�？焖佟�(zhǔn)確的農(nóng)藥多殘留檢測方法已成為國內(nèi)及國際上的重點研究方向。
目前，常用的農(nóng)殘篩查多用串接氣質(zhì)或者串接液質(zhì)檢測來實現(xiàn)。串接質(zhì)譜由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)，因而被廣泛得應(yīng)用在食品及農(nóng)產(chǎn)品中的多殘留分析檢測中。但是，隨著樣品基質(zhì)越來越復(fù)雜, 農(nóng)藥檢測數(shù)目的增加以及痕量分析的要求，三重四極桿質(zhì)譜一般采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的掃描模式，由于其固定目標(biāo)化合物，帶有一定的局限性。四極桿-飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF）和靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（Orbitrap）采用高分辨全掃描的方式（無限制目標(biāo)化合物）在很大程度上彌補(bǔ)了這個缺陷，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的快速篩查。
對于高分辨選擇性上，只有當(dāng)分辨率高于 50,000 時，高分辨全掃描方式的選擇性才會體現(xiàn)出好于三重四極桿質(zhì)譜MRM 的掃描模式，即交叉點 [4] 。因此在樣品篩查分析過程中，Q Exactive-GC高分辨質(zhì)譜參數(shù)選擇了 60,000（ m/z 200）以上的分辨率，大大提高了農(nóng)藥殘留定性篩查的速度和結(jié)果的可靠性，同時獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。
Q Exactive - GC，作為一款氣質(zhì)高分辨產(chǎn)品，基于 Orbitrap 靜電場軌道阱技術(shù)獨特的高分辨率和高質(zhì)量精度測定原理以及優(yōu)良的穩(wěn)定性和操作性，分辨率高達(dá) 120,000 FWHM（200 m/z ），同時保持良好的靈敏度。去掉其全掃描和高掃描速度，使得無需考慮化合物數(shù)量上的限制，從而達(dá)到大量農(nóng)藥同時篩查的目的，并滿足在復(fù)雜基質(zhì)中檢測低濃度農(nóng)藥殘留和提供（對樣品中其它成分）回顧性研究。不僅如此，Orbitrap 可將化合物的精確質(zhì)量數(shù)與保留時間、同位素強(qiáng)度、同位素分布等信息結(jié)合，從而實現(xiàn)農(nóng)藥的快速、準(zhǔn)確篩查。
本研究基于 Thermo Fisher Scientific 最新氣質(zhì)高分辨產(chǎn)品，建立了 435 種農(nóng)藥化合物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，可在 35 分鐘內(nèi)完成樣品數(shù)據(jù)采集以及農(nóng)藥未知物篩查的工作，具有靈敏度高、分辨率好，特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點。在常見水果蔬菜農(nóng)藥多殘留檢測中獲得良好的效果。
2.實驗部分
2.1 儀器和方法
2.1.1 氣相條件
儀器型號：Thermo Scientific TM TRACE 1310 GC
進(jìn)樣體積：1.0 µL
襯管：PTV 不分流進(jìn)樣
不分流時間：1 min
載氣：氦氣，1.2 mL/min
柱溫箱溫度程序：初始溫度 40 ℃，保持 1.5 min；以 25 ℃/min升至 90 ℃，保持 1.5 min；以 25 ℃/min 升至 180 ℃，保持0 min；5 ℃/min 升至280℃，保持 0 min；10 ℃/min升至300 ℃，保持3 min。
2.1.2 質(zhì)譜條件
儀器型號：Thermo Scientific TM Q Exactive-GC 質(zhì)譜儀
傳輸線：250 ℃
離子化類型：EI
離子源：280 ℃
電子能量：70 eV
采集模式：高分辨全掃描（FullScan）
質(zhì)量分辨率：60,000 FWHM（200 m/z ）
掃描范圍：50-700 m/z
2.2 樣品前處理方法：
1. 水果蔬菜樣品
基于《GBT 23206-2008果蔬汁、果酒中 512 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，以正己烷為定容液 [5] 。
3.實驗與結(jié)果
3.1 高分辨質(zhì)譜的定性能力
按照歐盟方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜方法必須達(dá)到4個定性點的確證要求[6] ，對于三重四極桿串接，通常只檢測2對母離子和子離子，因此其定性點往往只有4-5個；而對于高分辨質(zhì)譜，由于其對精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行全掃描測定，因此其每個離子被定義為2個定性點，相對豐度在基峰 10% 以上的離子可以作為定性離子使用。因此，按照以上規(guī)則，Q Exactive-GC 所采集數(shù)據(jù)的定性點均在4個以上，并可以實現(xiàn)全掃描圖譜的庫檢索工作。在化合物的準(zhǔn)確定性上具有強(qiáng)大優(yōu)勢。
3.2 儀器性能
3.2.1 掃描速度
通常情況下農(nóng)藥的峰寬在 3-10 s（與色譜峰的位置及濃度有關(guān)）之間，每一個色譜峰至少要滿足 8-10 掃描點數(shù)以保證數(shù)據(jù)采集的準(zhǔn)確性。
Q Exactive-GC 在 60, 000 分辨率下，仍能達(dá)到 7.0 spectrum/s以上的采集速率，使數(shù)據(jù)獲得足夠多的掃描點數(shù)。同時更重要的是每個掃描點數(shù)上質(zhì)量準(zhǔn)確度可以保持在 1.0 ppm 以內(nèi)，保證了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。如圖 1 所示。
3.2.2 質(zhì)量準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性
超高分辨率使儀器精確質(zhì)量數(shù)測定上的優(yōu)勢得到了完美發(fā)揮，有利于對未知化合物進(jìn)行定性定量測定。但精確質(zhì)量數(shù)
的測定會受到基質(zhì)干擾、化合物濃度、儀器狀態(tài)、外部環(huán)境等因素的影響，保證較低的精確質(zhì)量數(shù)偏差，才能使定性的確證度更高。實驗中測定了1345個碎片離子，其實測值與理論值的質(zhì)量偏差均在 1 ppm 范圍內(nèi)，如圖 2 所示。結(jié)果表明，Q Exactive-GC 在大量的數(shù)據(jù)采集過程中能保持良好的質(zhì)量偏差，結(jié)果可靠性更高。
實驗同樣對于化合物每個采集點的質(zhì)量精度進(jìn)行了探究，化合物毒死蜱（Chlorpyrifos）每個采集點中，碎片離子
（196.91964）的質(zhì)量偏差均能保持在 0.5 ppm 內(nèi)，如圖3所示。Q Exactive-GC 在每個掃描過程中，均可保持良好的質(zhì)量精度。
3.2.3 超高分辨性能
在有基質(zhì)干擾時，分辨率的高低會影響到精確質(zhì)量的測定。超高分辨率會提高儀器精確質(zhì)量數(shù)測定的準(zhǔn)確性，可以對精確質(zhì)量極為接近的化合物進(jìn)行有效鑒別。實驗中，分別在四種不同分辨率（15,000；30,000；60,000；120,000）下對化合物 10 µg/L 氯苯胺靈（Chlorpropham）碎片離子（m/127.01833）在大蔥樣品的測定結(jié)果，當(dāng)分辨率低于 60,000時，離子與同重元素的干擾離子無法分開。因而在判斷上會發(fā)生假陰性或假陽性結(jié)果。只有當(dāng)分辨率在60,000 及以上時，兩個同重元素離子可以明顯區(qū)分，并可以對氯苯胺靈快速判斷和準(zhǔn)確定量，如圖4所示。
3.2.4 超強(qiáng)的抗干擾能力
實驗同樣考察了對于相對復(fù)雜的基質(zhì)，Q Exactive-GC 基于高分辨率及高質(zhì)量精度，可通過精確質(zhì)量數(shù)達(dá)到完美的色譜分離。如圖5所示，煙草基質(zhì)中，低濃度下（10.0 µg/L）仍能得到高質(zhì)量的色譜峰。
3.3 篩查數(shù)據(jù)庫（Database）的建立
本實驗選取了435種農(nóng)藥化合物，配制成2.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，由儀器測定，在全掃描模式（FullScan）下獲得相應(yīng)化合物的保留時間，碎片離子的精確分子量、化學(xué)式等信息。每種化合物選取 2-5 個碎片離子，獲得離子信息（精確質(zhì)量、化學(xué)式）。數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinder中，建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫（Database）。如圖 6 所示。TraceFinder不僅可以實現(xiàn)數(shù)據(jù)快速、批量、自動化處理，而且集成定性、定量及方法建立等功能，根據(jù)建立的Database可實現(xiàn)目標(biāo)物篩查（Targeted Screening），對檢測樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速篩查。Database 中主要包含化合物名稱、CAS 登記號、碎片離子信息（精確質(zhì)量、化學(xué)式），保留時間等信息。
3.4 篩查參數(shù)的優(yōu)化
保留時間是化合物在色譜條件下的特征參數(shù)。對于本實驗而言，定性主要依賴于精確質(zhì)量數(shù)，但同時保留時間的限定可有效降低假陽性結(jié)果的檢出，提高篩查的準(zhǔn)確性以及速度。Trace1310 氣相色譜具有高度的穩(wěn)定性，保證了化合物保留時間的穩(wěn)定性。多次測定，同一化合物的保留時間偏差均在±0.1 min 范圍內(nèi)，考慮到基質(zhì)干擾對保留時間造成的偏移，實驗將保留時間偏差設(shè)定在 ±0.2 min 范圍內(nèi)�；衔锞邆涞耐凰卮匦畔τ诙ㄐ跃哂兄匾饬x，對于本次研究的農(nóng)藥化合物其元素組成主要以 C, H, O, N, P, S, F, Cl,Br, I 為主，其中 C, S, Cl, Br同位素的貢獻(xiàn)均超過了1.0%，特別是Cl和Br的同位素貢獻(xiàn)占到了32.0%和97.3%，并且隨著化合物中元素個數(shù)的增加，同位素貢獻(xiàn)呈現(xiàn)上升的趨勢。
本實驗中，化合物的同位素分布與同位素豐度信息在檢索得分中具有重要貢獻(xiàn)，其作為篩查的一項重要參數(shù)和判斷依據(jù)。TraceFinder可根據(jù)離子的化學(xué)式自動生成相應(yīng)的同位素峰理論信息，自動與測定值相比較。以農(nóng)藥除草醚（Nitrofen）為例，其基峰離子化學(xué)式為 C 12 Cl 2 H 7 NO 3 ，實際測得同位素峰簇的每個精確質(zhì)量數(shù)和其豐度比都與理論值相匹配。如圖 7 所示。
3.5 篩查結(jié)果
本實驗配置了溶劑標(biāo)準(zhǔn)與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)對農(nóng)藥化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了驗證，選取了 2 種常見的水果蔬菜樣品（蘋果及黃瓜）。結(jié)果顯示，10.0 µg/kg 濃度下，435 種化合物均能檢測到。
實際樣品中，10.0 µg/kg 濃度下，所有化合物峰形良好，碎片離子均能檢出且離子比率高度匹配。如圖 8 所示。
所有農(nóng)藥能夠在一律標(biāo)準(zhǔn)（10.0 µg/kg）下定性檢出，方法的靈敏度完全能夠滿足農(nóng)殘日常檢測的需要。實驗同時考察了10.0 µg/kg 以下，農(nóng)藥檢出情況。對于部分農(nóng)藥，即使在0.1 µg/kg極低濃度下，仍能得到滿意的檢測效果。如圖 9 所示。
本實驗主要是基于農(nóng)藥化合物精確質(zhì)量信息，來進(jìn)行農(nóng)藥殘留篩查。因此，需要對 Database 為基本的篩查限進(jìn)行研
究。以蘋果、黃瓜空白樣品制備濃度為 0.1, 0.5, 1.0, 10.0,20.0, 50.0 µg/kg（435 種農(nóng)藥）的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行測定。采用篩查數(shù)據(jù)庫對測定結(jié)果進(jìn)行 Targeted Screening，對于蘋果、黃瓜 2 種基質(zhì)中農(nóng)藥檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1.0 µg/kg 及以下濃度，檢出農(nóng)藥占比分別為 92.4%、93.6%（見圖 10）。由此可知，100% 以上的農(nóng)藥能夠在一律標(biāo)準(zhǔn)（10.0 µg/kg）下定性檢出，方法的靈敏度完全能夠滿足農(nóng)殘日常檢測的需要，絕大部分農(nóng)藥在較低濃度下仍能檢出。
4.結(jié)論
本實驗利用 Q Exactive-GC 超高分辨率、穩(wěn)定的質(zhì)量精度以及高靈敏度與 TraceFinder 軟件結(jié)合，建立了 435 種農(nóng)藥化合物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，利用化合物的精確質(zhì)量數(shù)與保留時間，同位素強(qiáng)度，同位素分布等信息結(jié)合，對不同基質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品樣品進(jìn)行快速篩查。實驗中儀器分辨率選擇了最少 60,000FWHM（200 m/z ）來提高檢測結(jié)果的可靠性，同時可以減少過多假陽性帶來判斷上的繁瑣，因此加快了篩查的速度和方便性。而在此分辨率下，篩查靈敏度可達(dá)到 10.0 µg/kg 或更低，完全能夠滿足農(nóng)殘日常檢測的需要。
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