甲基化與lncRNA：表觀遺傳學與轉錄組學研究的完美結合

2017年國自然申請的熱點什么？circRNA，lncRNA，外泌體。除了這些大家耳熟能詳的香饃饃之外，現在很多小伙伴們開始了新的玩法，通過多平臺聯用，將不同層面的東西結合起來，比如，表觀遺傳與非編碼RNA的結合，就是一個很好的例證。

研究背景

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，特別在中國，由于環(huán)境的污染，肺癌的發(fā)生率也在持續(xù)升高。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見的一種，大約占了肺癌總量的85%，但是，目前我們對于NSCLC的理解還是處于初級階段。其中，表觀遺傳學和轉錄組學的研究為我們理解腫瘤的發(fā)生提供了很多的證據。那么，這兩個層面的分子又存在什么樣的關聯呢？本研究從甲基化，lncRNA和基因表達調控的角度出發(fā)，為我們理解NSCLC的發(fā)生和臨床診斷提供了新的靶標。

研究思路

研究結果

1． 鑒定NSCLC特異性lncRNA-mRNA

NSCLC在轉錄組層面，有哪些特異性表達的分子呢？利用轉錄組表達譜芯片（SBC human lncRNA array伯豪生物提供），研究人員發(fā)現有8500個lncRNA和1685個mRNA在癌和癌旁中有顯著差異。通過對這些差異基因分析相關性，發(fā)現有1345個lncRNA與mRNA存在cis關系，159個lncRNA與mRNA有trans關系。把這些與lncRNA關聯的cis mRNA進行IPA功能（IPA分析，詳情咨詢shbio）分析發(fā)現，主要的pathway涉及到腫瘤相關，包括細胞死亡與生存，細胞發(fā)育，細胞生長和增殖，表明這些關聯的lncRNA可能參與腫瘤發(fā)生過程。研究人員把其中的兩個lncRNA與mRNA(LOC146880/KPNA2，ENST00000439577/RCC2)作為后期驗證的重點。

2. lncRNA與甲基化關聯分析

除了轉錄組層面的變化，表觀遺傳層面會有什么差異呢？利用甲基化芯片，研究人員發(fā)現癌和癌旁共有113644個差異CpG位點。其中，cg12562461位點正好位于LOC146880的啟動子區(qū)，且在癌組織中甲基化程度低。因此，cg12562461的低甲基化正好與LOC146880的高表達相對應。

3.lncRNA/mRNA與臨床指標關聯性分析

通過qPCR，研究人員首先在大量樣本中（402個癌組織，105個癌旁組織）進行了驗證，發(fā)現LOC146880和KPNA2在癌中高表達，且兩者表達顯著相關。進一步分析LOC146880和ENST00000439577與病人臨床指標，發(fā)現LOC146880與病理類型和腫瘤大小有關，ENST00000439577的表達與轉移狀態(tài)和疾病stage有關。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，training組和validation組中，高的LOC146880伴隨著低的總生存期。同時，在126個癌組織和30個癌旁中，cg12562461的甲基化程度也明顯低于癌旁。同樣，ENST00000439577和RCC2的表達也是在癌組織中高，兩者表達正相關。高的ENST00000439577表達也與低總生存期相關。因此，這兩個lncRNA可以作為潛在的診斷指標。

4.lncRNA細胞系功能驗證

為驗證在肺癌中LOC146880的生物學功能，研究人員分別檢測了三個NSCLC細胞系（A549，PC9，H1299）和正常細胞系，發(fā)現LOC146880在A549和PC9中表達高。當在這兩個細胞系中siRNA- LOC146880敲降，發(fā)現KPNA2的表達也隨之降低。此外，細胞增殖，遷移和侵襲受到抑制，細胞周期過程減慢了G2/M phase。因此，這些結果都表明LOC146880可能是NSCLC的致癌因子。

基于TRANSFAC預測，研究人員發(fā)現LOC146880的CpG位點區(qū)有轉錄因子SP1的結合位點。當將LOC146880的啟動子區(qū)載體構建（pGL3- LOC146880），和SP1過表達載體同時轉染HEK293T，A549，H1299時，發(fā)現pGL3- LOC146880顯著激活。因此，SP1確實能結合到LOC146880啟動子區(qū)，通過轉錄調控影響其表達。

在NSCLC三個細胞系（A549，H1975，H1299）和正常細胞系檢測ENST00000439577表達，發(fā)現比正常細胞系中都高。當在A549，H1299中siRNA干擾后，RCC2表達也降低，細胞增殖，遷移和侵襲也降低，細胞在G2/M phase稍微降低。因此，ENST00000439577可能也是肺癌的一個致癌因子。

研究結論

該研究通過將表達譜芯片與甲基化芯片結果進行關聯分析，找到了啟動子區(qū)甲基化降低，同時基因表達升高的lncRNA，并發(fā)現他們的表達與cis靶基因KPNA2和RCC2的表達正相關，并與低生存期相關。細胞系的siRNA干擾，功能實驗驗證表明，這兩個lncRNA抑制了細胞增殖，侵襲和轉移。該研究同時將表觀遺傳和轉錄關聯起來，從更全面的角度去理解了lncRNA在非小細胞肺癌中的作用。這種平臺聯用的方式是該研究的亮點，也是現在最新的流行趨勢，非常值得借鑒。

原文出處：Feng N, Ching T, Wang Y，et al. Analysis of Microarray Data on Gene Expression and Methylation to Identify Long Non-coding RNAsin Non-small Cell Lung Cancer. Sci Rep.2016.