基于高分辨質(zhì)譜的組學(xué)分析方法在白酒香型鑒別中的應(yīng)用
程明川，李晨，呂辰，江崢
賽默飛世爾科技（中國）公司，上海，中國 201206
關(guān)鍵詞
Q Exactive；靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜；組學(xué)分析；白酒；香型鑒別
1.引言
白酒在中國有著悠久的生產(chǎn)歷史, 是我國優(yōu)秀而寶貴的民族遺產(chǎn)，與白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒、金酒并列為世界6大蒸餾酒。我國固態(tài)發(fā)酵白酒質(zhì)量的影響因素很多, 每個生產(chǎn)批次所產(chǎn)酒的酒質(zhì)是不一致的。為了統(tǒng)一達(dá)到本品所固有的各種微量成分和它們之間適宜的比例，就必須進(jìn)行勾兌。經(jīng)過勾兌后的成品白酒, 具有其固定的化學(xué)成分組成以及這些成分之間的固定量比關(guān)系,從而形成各自不同的香型和風(fēng)味[1]。目前對白酒香氣成分的分析多采用 GC 或 GC/MS的方法[2]。而對于香型的鑒定，主要依靠品酒師的感官鑒別。該方法簡單快捷，但對人員要求較高，且較為主觀。也有采用電子舌技術(shù)對不同香型的白酒進(jìn)行區(qū)分[3]，但電子舌技術(shù)尚有待進(jìn)一步發(fā)展且通用性較差。本實驗采用超高效液相色譜（UHPLC）和基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜技術(shù)的Q Exactive臺式質(zhì)譜儀，結(jié)合組學(xué)分析軟件SIEVE和統(tǒng)計學(xué)軟件SIMCA對不同香型的白酒進(jìn)行了組學(xué)研究，利用多元統(tǒng)計分析建立了一種快速、準(zhǔn)確、客觀地鑒別白酒香型的新方法，并對找到的標(biāo)志物進(jìn)行了鑒定。
2.樣品信息及分析流程
實驗分別收集了濃香型、醬香型和清香型三種香型的白酒樣品。每種香型內(nèi)均包含不同品牌，不同品質(zhì)等級等多個樣本。因白酒樣本復(fù)雜，在不同品牌或是同一品牌不同等級之間存在多樣性和差異性，為減少不確定因素，先將三個香型的樣本分成不同品牌和同一品牌不同等級兩個組，分別進(jìn)行分析和比較。
不同品牌組：每種香型包含各個名優(yōu)品牌中最具有代表性的高端酒樣，每個樣本均是對應(yīng)香型中的典型樣本。力求通過對該組的分析找出不同品牌之間按照香型區(qū)分的標(biāo)志物。具體樣品信息見表 1。
不同等級組：每種香型包含同一典型品牌中從高端到低端的不同等級的樣本。對該組的分析可以找出不同等級的樣本之間共有的可以區(qū)分其他香型的標(biāo)志性化合物，也可驗證在對不同品牌組分析中找到的典型標(biāo)志性化合物是否存在于該品牌各個等級的樣品中。具體樣品信息見表 2。
為了最大程度地保留樣本內(nèi)的化學(xué)成分，樣本僅使用0.22µm的濾膜過濾后，即采用正負(fù)切換掃描的方式對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。數(shù)據(jù)用 SIEVE 軟件進(jìn)行峰提取、過濾、對齊和差異化比較；使用 SIMCA 進(jìn)行 PCA、OPLS-DA 等多元統(tǒng)計分析，并利用建立的數(shù)學(xué)模型對未知樣品進(jìn)行判別預(yù)測，分析流程見圖 1。
3.實驗條件
3.1液相色譜條件
色譜儀：Thermo Scientific TM Ultimate 3000 RSLC
色譜柱：Thermo Scientific TM Accucore C8 (100×2.1, 2.6 µm)
流動相組成和梯度洗脫條件見表 3。
4. 結(jié)果與討論
4.1 實驗條件的選擇
為保證白酒樣品中盡可能多的成分能夠有效地被測定，本實驗對不同型號的色譜柱進(jìn)行了考察，包括：AccucoreaQ、Accucore Hilic、Accucore C8、Syncronis C18 和Hypercarb。實驗結(jié)果表明 Accucore C8 色譜柱在正離子模式下能夠?qū)Π拙茦悠分械幕衔镞M(jìn)行較好的分離和有較高的響應(yīng)（圖 2）。
4.2 數(shù)據(jù)重現(xiàn)性
在組學(xué)相關(guān)試驗中，方法的重現(xiàn)性至關(guān)重要，需要保證數(shù)據(jù)在質(zhì)量精度、保留時間及響應(yīng)強(qiáng)度等方面具有很好的的重現(xiàn)性。本實驗在進(jìn)樣序列中穿插了 QC 樣品，對系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。在整個進(jìn)樣周期（48 小時）內(nèi)，保留時間（RT）偏差 ＜2 s，以某一化合物考察的響應(yīng)值（NL）RSD 為 10% 左右，質(zhì)量精度偏差在 1 ppm 以內(nèi)。實驗結(jié)果表明，采用外標(biāo)法進(jìn)行一次校正后，系統(tǒng)有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和質(zhì)量精度。
4.3 統(tǒng)計學(xué)分析
采用 SIEVE 軟件對組分進(jìn)行提取、過濾（P-Value ＜ 0.05）及統(tǒng)計學(xué)分析。不同品牌組和不同等級組分別得到 486 個和1246 個化合物。通過 SIMCA 軟件對上述化合物的 PCA 分析表明，在這兩個分析組中 3 種香型的白酒均能較好的分開，聚類趨勢明顯，無明顯離群組分且與其他組別有較明顯差異（圖 3）
采用 SIEVE 軟件找出所得化合物中ratio差別較大，且在XIC圖中有明確色譜峰的化合物，作為潛在標(biāo)志物，如圖 4 所示（以化合物 S1 示例）。最終在兩個分析組中分別確定的標(biāo)志物見表 5 和表 6。其中有 5 個化合物為兩個分析組的共有標(biāo)志物。以這 5 個共有標(biāo)志物為指標(biāo)，采用 SIMCA 軟件進(jìn)行正交校正偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異。分析結(jié)果表明三種香型的白酒可以得到良好的區(qū)分（圖 5）。
4.4 建模與預(yù)判
以此 OPLS-DA 分析的模型對已知另一典型濃香型白酒樣品（沱牌曲酒，50°）進(jìn)行預(yù)判分析，來考察選取的5個標(biāo)志物對3種香型白酒的鑒別能力。結(jié)果表明，測試樣品可以很好的和濃香型樣品聚合在一起，和另外兩種組能很好的區(qū)分，判斷結(jié)果正確（圖 6）。
4.5 標(biāo)志物鑒定
根據(jù)標(biāo)志物的精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布和二級碎片離子等信息，采用 Xcalibur 軟件、MassFrontier 軟件和 ChemSpider 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了鑒定和確證，鑒定結(jié)果見表 7。
5. 結(jié)論
本實驗展示了基于組學(xué)的分析方法在食品種類鑒別中的工作流程。結(jié)果表明 Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合組學(xué)分析軟件SIEVE 及統(tǒng)計學(xué)分析軟件 SIMCA，可以有效地鑒別濃香、醬香和清香三種香型的白酒。在實驗中鑒定到了 5 個共有標(biāo)志物，其中包括濃香型白酒被廣為認(rèn)知的特征成分己酸乙酯，與既有研究一致，也表明所選標(biāo)志物具有極高的可信度。通過對已知樣本的預(yù)判測試，顯示出所建立模型可以很好的用于三種香型白酒的區(qū)分。標(biāo)志物未在清香型白酒中發(fā)現(xiàn)，能與清香型白酒本身就分 3 種亞型有關(guān)。另外，通過樣本量的增加，所建立的模型進(jìn)行樣品預(yù)測的準(zhǔn)確度可能會進(jìn)一步提高。后續(xù)還可采用該流程和方法對 12 種白酒香型中的其他香型和不同年份的白酒樣品進(jìn)行分析和比較。利用本文建立的這一套工作流程，可以推廣到食品組學(xué)研究領(lǐng)域更廣范圍的品種鑒別、產(chǎn)地溯源、質(zhì)量控制等各個研究方向。
參考文獻(xiàn)
[1] 周圍，等。名優(yōu)白酒質(zhì)量指紋專家鑒別系統(tǒng)。分析化學(xué)，2006年4月，第32卷，735-740。
[2] 柳軍，等。應(yīng)用GC-O分析比較兼香型和濃香型白酒中的香氣化合物。釀酒，2008年5月35卷，103-107。
[3] 王永維，等�；陔娮由嗟陌拙茩z測與區(qū)分研究。包裝與食品機(jī)械，2009年第27卷第5期，57-61。
