ADC 單抗藥物的分子量、氨基酸序列、糖基化位點以及ADC 藥物結(jié)合位點鑒定

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

Q-Exactive；ADC 單抗藥物；分子量測定；氨基酸序列分析；糖基化位點分析；ADC 藥物結(jié)合位點分析

 

單克隆抗體藥物是具有高度特異性的靶向藥物，能夠特異性作用于腫瘤細胞，被譽為治療惡性腫瘤的“生物導彈”。ADC 抗體藥，則是在抗體蛋白的特定天然氨基酸上非定點偶聯(lián)具有抗腫瘤作用的化療藥物（或稱小分子藥物），以增加單克隆抗體的療效、并降低小分子藥物的副反應(yīng)。對此，研究人士表示，這相當于在“生物導彈”上精確地裝上了“核彈頭”，使得治療更加安全、有效、定向。目前，在整個腫瘤藥研究領(lǐng)域，ADC 抗體藥物已得到了業(yè)內(nèi)的普遍認可。不少跨國藥企相繼投身到 ADC 藥物的研究開發(fā)中。為了保證 ADC 單抗藥物的安全性和有效性，以及對單抗藥物生產(chǎn)過程進行實時監(jiān)控，對于 ADC 單抗藥物的整體分子量的測定、氨基酸序列的鑒定、糖基化位點的確認、ADC 藥物結(jié)合位點的確認、二硫鍵的定位、糖鏈結(jié)構(gòu)的解析等重要的 ADC 藥物分析指標的測試和確認，越來越受到各大制藥公司的關(guān)注。目前，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，基于生物質(zhì)譜的單抗分析技術(shù)也開始全面、快速的建立起來。

 

Q-Exactive 串聯(lián)質(zhì)譜儀結(jié)合了高選擇性的四級桿質(zhì)譜檢測器和高分辨、高靈敏度的 Orbitrap^TM 質(zhì)量分析器，大大提高了離子的選擇性、靈敏度和質(zhì)量精度。該系統(tǒng)具有 140,000 的分辨率（FWHM）、更高的靈敏度、更快的掃描速度和更大的動態(tài)范圍，同時結(jié)合了 HCD 碎裂技術(shù)，可以實現(xiàn)串級質(zhì)譜碎裂和鑒定，為深度復雜樣品分析，包括蛋白質(zhì)組學、代謝組學、脂類組學等樣品的鑒定，翻譯后修飾和定量分析，提供了全面、高效和快速的質(zhì)譜分析平臺。同樣，Q-Exactive 質(zhì)譜可以有效地應(yīng)用到 ADC 單抗藥物的研發(fā)和生產(chǎn)監(jiān)控中，基本的實驗分析流程如下所示。

 

圖 1. 單抗分析基本流程圖

 

 

2.1.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Agilent Zorbax 300, SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm ；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸。

 

2.1.2 儀器方法

 

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 單抗分子量測定的色譜分析條件

流動相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱溫	75℃
色譜梯度	時間/min	B相濃度/%
	0	5
	4	5
	12	90
	12.1	90
	16	90
	16.5	5
	20	5

 

表 2. 單抗分子量測定的質(zhì)譜分析條件

噴霧電壓	4 kV
毛細管加熱溫度	275℃
S-lens	60 %;
鞘氣流速	30（arb）
輔助氣流速	5（arb）
質(zhì)量掃描范圍	m/z 2000–4000
分辨率	17,500（m/z 200）
源內(nèi)裂解（SID）	100 eV
Microscan	10

 

 

2.2.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Thermo Scientific, C18, 100Å ,1.9 μm, 2.1×100 mm

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸。

 

2.2.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 3；

 

表 3. 氨基酸序列測定的色譜分析條件

流動相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱溫	35℃
色譜梯度	時間/min	B相濃度/%
	0	5
	4	5
	45	35
	50	90
	52	90
	52.5	5
	60	5

 

質(zhì)譜分析條件：具體見表 4；

 

表 4. 氨基酸序列測定的質(zhì)譜分析條件

噴霧電壓	3.5 kV
毛細管加熱溫度	275℃
S-lens	60 %;
碰撞能量	27% 歸一化能量
碎裂方式	HCD
質(zhì)量掃描范圍	m/z 300–1800
分辨率	一級35,000（m/z 200）,
	二級17,500（m/z 200）

 

2.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 軟件對原始譜圖進行數(shù)據(jù)庫搜索，具體搜庫參數(shù)為：包含單抗氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設(shè)置為固定修飾；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）、天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）、賴氨酸（K）ADC結(jié)合（+956.3644Da）、天冬酰胺（N）G0F糖基化（+1444.5300Da）設(shè)置為可變修飾；trypsin 設(shè)置為酶；酶漏切位點為 2。

 

 

基于高分辨質(zhì)譜 Q-Exactive，為了保證采集譜圖的質(zhì)量和數(shù)量，我們設(shè)定 Orbitrap 檢測器的采集分辨率為 17,500。經(jīng)過 Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 ADC 單抗藥物的原始色譜質(zhì)譜總離子流圖和原始質(zhì)譜圖如圖 2 和 3 所示，我們可以觀察到 ADC 抗體藥物在整個質(zhì)量范圍內(nèi)表現(xiàn)出均勻的電荷分布，不同電荷的質(zhì)譜峰之間可以實現(xiàn)基線分離，從而可以判斷質(zhì)譜的靈敏度、分辨率和信噪比都很高。同時選取強度較高的幾組質(zhì)譜峰進行放大，放大之后的幾組質(zhì)譜峰顯示相似的分布模式。

 

圖 2. ADC 抗體藥物色譜質(zhì)譜流出圖

 

 

圖 3. ADC 抗體藥物原始質(zhì)譜圖（紅色虛線框內(nèi)為中間幾組峰的放大圖）

 

經(jīng)過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子量分布圖如下所示（圖 4），根據(jù)單抗的氨基酸理論序列分子量進行計算，將觀察到的質(zhì)譜峰進行歸屬，從圖中我們觀察到，該 ADC 單抗分子之間存在 956 Da 左右的質(zhì)量增加，由此推斷該單抗分子結(jié)合了不同數(shù)目的分子量在 956 Da 左右的藥物小分子，并且最多可以檢測到 6 個藥物小分子的結(jié)合。同時還觀察到 160 Da 左右的質(zhì)量增加，這主要是由于連接基團的存在引起的。從而初步推斷該 ADC 單抗藥物主要結(jié)合了 6 個 ADC 小分子藥物，該結(jié)果與理論值基本一致，同時根據(jù)質(zhì)譜峰的峰強度信息，我們還可以計算得到該藥物的 ADR 值，該數(shù)值對于 ADC 藥物的有效性評估至關(guān)重要。

 

 

圖 4. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 ADC 單抗原始質(zhì)譜圖經(jīng)過 Protein

Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子量分布圖

（D0–D6 表示不同 ADC 藥物小分子結(jié)合的單抗變體，藍色圓圈表示連接基團對應(yīng)的質(zhì)譜峰。）

 

3.2.1 氨基酸序列覆蓋

通過 trypsin 酶解后的肽段，在 Q-Exactive 質(zhì)譜上采集到的色譜質(zhì)譜流出圖如圖 5 所示，再經(jīng)過 SEQUEST 數(shù)據(jù)庫搜索后，ADC 單抗重鏈的蛋白序列覆蓋度為 90.24 %，如圖 6（A）所示，輕鏈的蛋白序列覆蓋度為 100 %，如圖 6（B）所示，其中未鑒定到的氨基酸序列主要是由于缺乏酶切位點和酶切后肽段較短造成的，為了實現(xiàn) 100% 的氨基酸序列覆蓋，可以通過選擇其它內(nèi)切蛋白酶來實現(xiàn)。

 

 

圖 5. ADC 單抗藥物的 Trypsin 酶解肽段的色譜質(zhì)譜流出圖

 

 

圖6. ADC 抗體藥物經(jīng)過 trypsin 酶解和 Q-Exactive 質(zhì)譜實現(xiàn)的氨基酸序列覆蓋度示意圖。（A 為重鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，B 為輕鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，其中綠色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性非常高，達到 99% 以上，紅色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性為 95% 以下，無顏色標記的氨基酸序列表示該段序列沒有被鑒定到，氨基酸序列上方的數(shù)字代表氨基酸的位置。）

 

ADC 單抗蛋白與其他單抗蛋白相同，也都包含 N-糖基化修飾，一般發(fā)生在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 為除脯氨酸外的任意氨基酸）。在糖鏈完整的情況下，直接進行 trypsin 酶解，我們在搜庫時進行 G0F 糖基化可變修飾設(shè)定，可以直接獲得該 N 糖基化位點：重鏈氨基酸序列 EEQY N261STYR 中的 N261 位點，下圖為該肽段的 G0F 串級質(zhì)譜圖，除了圖中黃色和藍色代表的該肽段的 b、y 碎片離子外，紅色圓圈所示的為該糖肽的糖特征碎片離子（低 m/z 端）和糖肽碎片離子（高 m/z 端），從而可以準確確證該糖肽和糖基化位點的存在。

 

圖 7. 重鏈氨基酸序列 EEQYN261STYR 的串級質(zhì)譜圖

 

根據(jù) Proteome Discovery 軟件搜庫結(jié)果顯示，我們發(fā)現(xiàn)在賴氨酸結(jié)合藥物分子的肽段的串級質(zhì)譜圖中存在特征碎片離子 453.20、485.23 和 547.21，因此我們通過這些特征碎片對所有的可能發(fā)生 ADC 結(jié)合的肽段的串級質(zhì)譜圖進行人工確認，最終準確確認了輕鏈中 2 個賴氨酸位點和重鏈中 7 個賴氨酸位點發(fā)生了 ADC 小分子藥物結(jié)合，具體位點如下圖（圖 8）所示，并且以其中一條肽段為例，給出了 ADC 結(jié)合肽段的串級質(zhì)譜圖（圖 9），紅色圈表示 ADC 特征碎片離子。同時我們也觀察到 ADC 藥物結(jié)合后的肽段的疏水性比較強，色譜流出比較靠后，這一現(xiàn)象完全符合理論推測。

 

圖 8. ADC 藥物小分子結(jié)合位點示意圖

 

 

圖 9. ADC 結(jié)合肽段 VSNKALPAPIEK 的串級質(zhì)譜圖

 

本文通過 Q-Exactive 質(zhì)譜建立了 ADC 單抗藥物的整體分子量測定、氨基酸序列鑒定、糖基化位點和 ADC 藥物結(jié)合位點確認的分析方法，為 ADC 單抗藥物研發(fā)分析和實時生產(chǎn)檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結(jié)果表明 Q-Exactive 串聯(lián)質(zhì)譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質(zhì)量精度、超低的靈敏度和超大的動態(tài)范圍，極大地完善和推動了 ADC 單抗藥物的鑒定分析。

 

 

     Orbitrap組學俱樂部                  賽默飛小分子質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)群