單抗藥物的分子質(zhì)量、氨基酸序列以及糖基化位點鑒定

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

LTQ-Orbitrap Elite；單抗藥物；分子質(zhì)量分析；氨基酸序列分析；糖基化位點分析

 

單抗藥物主要是由兩條重鏈和兩條輕鏈通過鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵以及非共價鍵組成，分子質(zhì)量大約在 150 kD 左右，每條重鏈和輕鏈在 N 端都包含一個可變區(qū)域，在 C 端都包含一個恒定區(qū)域，并且在每條重鏈上還存在一個 N 糖基化位點，該位點含有不同的糖鏈結(jié)構(gòu)，如圖 1 所示。目前，在生物制藥領(lǐng)域中，單抗藥物以其高效的治療靶向性和特異性，越來越受到制藥公司和醫(yī)療單位的青睞。為了保證單抗藥物的有效性，以及單抗藥物生產(chǎn)過程的實時監(jiān)控，對于單抗藥物的整體分子質(zhì)量的測定、氨基酸序列的鑒定，糖基化位點的確認，二硫鍵的定位，糖鏈結(jié)構(gòu)的解析等重要的分析技術(shù)，越來越受到制藥公司的關(guān)注。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，基于生物質(zhì)譜的單抗分析技術(shù)也開始全面、快速的開展起來。

 

目前，LTQ-Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀結(jié)合了以前的雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀和新型高場 OrbitrapTM 質(zhì)量分析器，提高了 MS和 MSn 的性能和多功能性。該系統(tǒng)具有高于 240,000 的分辨率（FWHM）、更高的靈敏度、高掃描速度和更大的動態(tài)范圍，同時結(jié)合了多種碎裂技術(shù)，為深度復(fù)雜樣品分析，包括蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂類組學(xué)等樣品的鑒定，翻譯后修飾和定量分析，提供了全面、高效和快速的質(zhì)譜分析平臺。

 

 

圖 1. 單抗藥物的簡單結(jié)構(gòu)示意圖（V 表示可變區(qū)域，C 表示恒定區(qū)域，L 表示輕鏈，H 表示重鏈。）

 

2.1.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：BioBasic 色譜柱（C8, 1×100 mm，5μm，300 Å）

（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸。

2.1.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

2.1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用 Protein Deconvolution 2.0 軟件對原始質(zhì)譜圖進行去卷積處理，得到完整的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量信息。

 

表 1. 單抗分子質(zhì)量測定的色譜分析條件

 

 

表 2. 單抗分子質(zhì)量測定的質(zhì)譜分析條件

 

 

2.2.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Easy-nLC 1000液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Nano 色譜柱（C18，75μm × 150 mm，2 μm,100Å）（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，PNGaseF 內(nèi)切糖苷酶，二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 內(nèi)切蛋白酶。

 

2.2.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 3；

 

質(zhì)譜分析條件：具體見表 4；

 

表 3. 氨基酸序列測定的色譜分析條件

表 4. 氨基酸序列測定的質(zhì)譜分析條件

 

2.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 軟件對原始譜圖進行數(shù)據(jù)庫搜索，具體搜庫參數(shù)為：包含單抗氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設(shè)置為固定修飾；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）設(shè)置為可變修飾；trypsin 設(shè)置為酶；酶漏切位點為 2。設(shè)置肽段的置信水平為 99%，得到高置信的鑒定肽段和蛋白結(jié)果。

 

2.2.4 樣品前處理方法

將單抗樣品首先進行 PNGaseF 酶解，切除糖鏈后的蛋白質(zhì)，再進行 DTT 還原和 IAA 烷基化，最后進行 trypsin 過夜酶解。

 

2.3.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Easy-nLC 1000 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Nano 色譜柱（C18，75 μm× 150 mm，2 μm,100Å）（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 內(nèi)切蛋白酶。

 

2.3.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 3；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 4；

 

2.3.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用 Byonic 1.1 軟件對原始譜圖進行數(shù)據(jù)庫搜索，具體搜庫參數(shù)為：包含單抗氨基酸序列和 N 糖基化結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設(shè)置為固定修飾；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）設(shè)置為可變修飾；trypsin 設(shè)置為酶；酶漏切位點為 2。最終通過人工確認，得到準確的糖基化修飾肽段的鑒定信息。

 

基于高分辨質(zhì)譜 LTQ-Orbitrap Elite，為了保證采集譜圖的質(zhì)量和數(shù)量，我們設(shè)定高場 Orbitrap 檢測器的采集分辨率為15,000。

 

經(jīng)過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜采集的單抗原始質(zhì)譜譜圖如圖 2-A所示，我們可以觀察到不同的電荷分布的質(zhì)譜圖，選取強度最高的 m/z 為 2744.0384 的一組質(zhì)譜峰為例，放大之后的質(zhì)譜峰如圖 2-B 所示，可以看到質(zhì)譜圖的靈敏度和信噪比都很高。

 

 

圖 2. LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜采集的單抗原始質(zhì)譜圖（A 為整體分布圖，B 為 m/z 為 2744.0384 的放大圖。）

 

經(jīng)過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子質(zhì)量分布圖（圖 3），根據(jù)單抗的氨基酸序列理論分子質(zhì)量進行計算，將觀察到的質(zhì)譜峰進行歸屬，可以初步推斷該單抗藥物存在多種形式的糖鏈結(jié)構(gòu)，主要包括 G0、G0F、G1F 和 G2F，該結(jié)論與常見的單抗組成基本一致，同時根據(jù)質(zhì)譜峰的峰強度信息，我們還可以計算得到不同糖型單抗的相對定量信息，如圖 3 中藍色數(shù)字所示。

 

圖 3. LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜采集的單抗原始質(zhì)譜圖經(jīng)過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子質(zhì)量分布圖（G0、G0F、G1F 和 G2F 表示不同類型的糖型，藍色數(shù)字表示質(zhì)譜峰所對應(yīng)的峰強度和相對定量信息。）

 

經(jīng)過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和 Proteome Discoverer 1.3 軟件的數(shù)據(jù)庫搜索，以及肽段 99% 高置信水平卡值，在 trypsin酶解實驗中，單抗重鏈的蛋白序列覆蓋度為 97 %，如圖 4-A 所示，輕鏈的蛋白序列覆蓋度為 98 %，如圖 4-B 所示，由此證明LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜可以準確、有效地實現(xiàn)單抗氨基酸序列的成功鑒定。其中未鑒定到的氨基酸序列主要是由于酶切后肽段過短不適合質(zhì)譜鑒定所造成的，為了實現(xiàn) 100% 的氨基酸序列覆蓋，可以通過選擇其它內(nèi)切蛋白酶來實現(xiàn)。

 

單抗蛋白中一般都包含 N-糖基化修飾，也就是說肽鏈的天冬酰胺（Asn，N） 殘基可以與糖鏈的還原端連接，形成不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖基化蛋白，一般發(fā)生 N-糖基化修飾的位點都是在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 為除脯氨酸外的任意氨基酸）。在經(jīng)過內(nèi)切糖苷酶 PNGase F酶切后，天冬酰胺（Asn，N）殘基會丟失糖鏈，產(chǎn)生 0.984 Da 的質(zhì)量增加。不過在樣品處理過程中也可能會導(dǎo)致天冬酰胺、谷氨酰胺發(fā)生脫氨基化，同樣會使天冬酰胺產(chǎn)生 0.984 Da 的質(zhì)量增加。最終的搜庫結(jié)果顯示一些天冬酰胺殘基存在0.984 Da 的質(zhì)量增加，這可能是由于樣品發(fā)生了脫氨基化或者 N 糖鏈被酶解所致，進一步結(jié)合 N 糖基化位點的特定 NX(X≠P)S/T結(jié)構(gòu)域信息，我們初步推斷該單抗中唯一可能發(fā)生糖基化的位點為：重鏈中氨基酸序列 EEQYNSTYR 中的 N 位點，為了得到準確的定性結(jié)果，我們進行了后續(xù)的糖基化位點鑒定實驗。

 

 

圖 4. 單抗經(jīng)過 trypsin 酶解和 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜實現(xiàn)的氨基酸序列覆蓋度示意圖（A為重鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，B 為輕鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，其中綠色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性非常高，達到 99% 以上，紅色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性為 95% 以下，無顏色標記的氨基酸序列表示該段序列沒有被鑒定到，氨基酸序列上方的數(shù)字代表氨基酸的位置。）

 

經(jīng)過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和 Byonic 1.1 軟件的數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定到 6 個糖基化修飾的肽段，分別對應(yīng)于 G0（ ）、G0F（ ）和G1F（ ）（紅三角表示巖藻糖，藍方塊表示 N-乙酰氨基葡萄糖，綠圓表示甘露糖，黃圓表示半乳糖）等，每一條糖肽都經(jīng)過人工確認，以其中的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽為例，如圖 5 所示，在二級質(zhì)譜中，可以觀察到 6 個糖診斷離子（見表 5）和 8 個糖肽碎片離子（見表 6），同時結(jié)合 N 糖基化修飾位點的特定結(jié)構(gòu)域信息，從而確證該肽段中天冬酰胺（N）殘基為 N-糖基化修飾位點。

 

由于采用了高分辨、高精度的 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜，糖診斷離子的質(zhì)量偏差都在 1 ppm 以內(nèi)，除了個別碎片離子外，基本所有的糖肽碎片離子的質(zhì)量偏差也都在 1 ppm 以內(nèi)，由此可以判斷該糖肽碎片離子的歸屬準確、可靠。

 

表 5. EEQYN（G0F）STYR 糖肽經(jīng)過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜鑒定到的糖診斷離子列表

 

表 6. EEQYN（G0F）STYR 糖肽經(jīng)過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜鑒定到的糖肽碎片離子列表（紅三角表示巖藻糖；藍方塊表示N-乙酰氨基葡萄糖；綠圓表示甘露糖）

 

圖 5. LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜采集的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽的二級質(zhì)譜圖（紅三角表示巖藻糖；藍方塊表示 N-乙酰氨基葡萄糖；綠圓表示甘露糖）

 

本文通過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜建立了單抗藥物的整體分子質(zhì)量測定、氨基酸序列鑒定和糖基化位點確認的分析方法，為常規(guī)單抗藥物研發(fā)分析和實時生產(chǎn)檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結(jié)果表明 LTQ-Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質(zhì)量精度、超低的靈敏度和超大的動態(tài)范圍，極大地完善和推動了單抗藥物的鑒定分析。