DNA & RNA 寡聚核苷酸的準(zhǔn)確分子質(zhì)量測(cè)定

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

LTQ-Orbitrap Elite；核酸藥物；分子質(zhì)量測(cè)定

 

隨著人們對(duì)核酸結(jié)構(gòu)和功能的深入了解,特異性結(jié)合或者裂解致病基因的核酸藥物也逐漸成為了藥物研究的新熱點(diǎn), 核酸藥物的作用效率高、應(yīng)用范圍廣，可以對(duì)傳統(tǒng)藥物進(jìn)行補(bǔ)充，并且在前期的臨床診斷中也可以起到重要的指示作用。核酸藥物主要是指各種具有不同功能的寡聚核糖核苷酸（RNA）或者寡聚脫氧核糖核甘酸（DNA），主要作用于基因水平，在信息流傳遞的上游階段起作用，效率比較高，且通過結(jié)合或者裂解特異性的致病基因，而對(duì)其它基因沒有任何影響。在信息流的傳遞過程中，信號(hào)逐級(jí)放大，一個(gè)基因可以轉(zhuǎn)錄出多個(gè) mRNA，一個(gè) mRNA 又可以翻譯出多個(gè)蛋白質(zhì)，所以與作用于信息流最終產(chǎn)物-蛋白質(zhì)相比，核酸藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。目前的核酸藥物可以與一些轉(zhuǎn)錄因子、凝血酶、人類免疫缺陷病毒、雙鏈 DNA 的特殊部位等結(jié)合，從而抑制 DNA 的復(fù)制或者蛋白、受體等的結(jié)合，從而干擾和阻止病毒或者錯(cuò)誤基因和蛋白的表達(dá)和放大，因此在基因藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程中，建立和發(fā)展一種更有效、靈敏、快速和精確的寡聚核苷酸的結(jié)構(gòu)和序列分析方法，一直都是生物化學(xué)家、醫(yī)藥工作者和儀器分析公司的研究課題之一。

 

生物質(zhì)譜的技術(shù)為寡聚核苷酸的分子質(zhì)量和序列分析提供了新的途徑。之前，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF）主要用于分子質(zhì)量比較小的寡聚核苷酸分析，受儀器的靈敏度，分辨率，堿金屬離子加合峰的影響，測(cè)試的精確度和可靠性都存在一定問題。另外，基于常規(guī)的電噴霧離子阱（Ion Trap）質(zhì)譜的檢測(cè)，同樣受限于分辨率與質(zhì)量精度，也無(wú)法滿足高精度、高分辨、高靈敏的寡聚核苷酸的檢測(cè)分析。

 

LTQ-Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀結(jié)合了最新的雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀和新型高場(chǎng) OrbitrapTM 質(zhì)量分析器，可以提供高達(dá)240,000 的分辨率（FWHM）、高靈敏度、快速的掃描速度和更大的動(dòng)態(tài)范圍，并且可以在同一臺(tái)質(zhì)譜上可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)低分辨和高分辨掃描，滿足客戶的不同需求。該系統(tǒng)可以為寡聚核苷酸的分子質(zhì)量測(cè)定提供準(zhǔn)確、快速、可靠的分析測(cè)試。

 

質(zhì)譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

色譜柱：BioBasic 色譜柱（C8, 2.1×50 mm，5 μm，300 Å）（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

試劑：乙酸銨、二次去離子水，色譜級(jí)甲醇。

 

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 寡聚核苷酸分子質(zhì)量測(cè)定的色譜分析條件

 

表2寡聚核苷酸分子質(zhì)量測(cè)定的質(zhì)譜分析條件

 

采用 ProMass 軟件對(duì)原始質(zhì)譜圖進(jìn)行去卷積處理，得到完整的寡聚核苷酸的分子質(zhì)量信息。

 

3.1 低分辨 LTQ 質(zhì)量檢測(cè)器測(cè)定寡聚核苷酸的分子質(zhì)量

3.1.1 原始色譜質(zhì)譜圖

 

 

采用 5 min 的梯度分析，離子阱采集數(shù)據(jù)，寡聚核酸主要在 3.53 min 出峰。

 

3.1.2 原始質(zhì)譜圖

 

 

將上圖中 3.53 min 附件的寡聚核苷酸譜圖信號(hào)平均后，得到該寡聚核苷酸的平均質(zhì)譜圖，由于 LTQ 的分辨率有限，無(wú)法將電荷直接分辨出來，因此需要通過軟件進(jìn)行去卷積處理，從而得到該寡聚核苷酸的分子質(zhì)量。

 

3.1.3 去卷積之后的質(zhì)譜結(jié)果

 

通過 ProMass 軟件去卷積之后的平均分子質(zhì)量為 9247.3，與理論的平均分子質(zhì)量完全一致，并且 ProMass 軟件對(duì)原始質(zhì)譜圖中質(zhì)譜峰的電荷進(jìn)行了歸屬，如下所示，質(zhì)荷比為 1540.2 的質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)的電荷為 –6 價(jià)，質(zhì)荷比為 1848.5 的質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)的電荷為–5 價(jià)。

 

3.2.1 原始色譜質(zhì)譜圖

 

 

與低分辨的實(shí)驗(yàn)相比，在保持上樣量和色譜條件不變的前提下，僅僅改變質(zhì)譜采集的分辨率，可以看到寡聚核苷酸的色譜保留時(shí)間不變，基本在 3.52 min 出峰，不過隨著質(zhì)譜檢測(cè)器分辨率的提高，原始質(zhì)譜圖發(fā)生了顯著的變化，如下所示，當(dāng)使用線性離子阱 LTQ 作為質(zhì)量檢測(cè)器時(shí)，只檢測(cè)到一個(gè)大包峰，無(wú)法分辨電荷；當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測(cè)器，分辨率 R 設(shè)置為 15000 時(shí)，同樣也只檢測(cè)到一個(gè)大包峰，電荷仍然無(wú)法分辨；當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測(cè)器，分辨率 R 設(shè)置為 30,000 時(shí)，可以觀察到一些同位素峰，電荷可以實(shí)現(xiàn)分辨；當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測(cè)器，分辨率 R 設(shè)置為 60,000 時(shí)，可以觀察到稍微好一些的同位素峰，但無(wú)法完全分離，電荷同樣可以實(shí)現(xiàn)分辨；當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測(cè)器，分辨率 R 設(shè)置為 120,000 時(shí)，同位素峰可以實(shí)現(xiàn)完全分離，電荷同樣也可以實(shí)現(xiàn)分辨；當(dāng)使用 Orbitrap 作為質(zhì)量檢測(cè)器，分辨率 R 設(shè)置為 240,000 時(shí)，同位素峰可以實(shí)現(xiàn)完全分離，并且峰形更加尖銳，電荷同樣也可以實(shí)現(xiàn)分辨，由此我們可以準(zhǔn)確的計(jì)算得到寡聚核苷酸的單同位素質(zhì)量和平均質(zhì)量，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量保持完全一致。

 

 

同樣，我們對(duì)幾個(gè)不同分子質(zhì)量的寡聚核苷酸進(jìn)行了不同分辨率的質(zhì)譜測(cè)試，結(jié)果如下所示：

 

 

從上面的質(zhì)譜圖中，可以看到，隨著質(zhì)譜分辨率的提高，寡聚核苷酸的同位素峰可以實(shí)現(xiàn)完全分離，并且峰寬更窄，電荷也可以實(shí)現(xiàn)完全分辨，并且無(wú)需軟件輔助，就可以直接計(jì)算得到寡聚核苷酸的單同位素質(zhì)量和平均分子質(zhì)量，使得寡聚核苷酸的分析測(cè)試更加快速和直接。

 

本文通過 LTQ-Orbitrap Elite 質(zhì)譜建立了寡聚核酸藥物分子質(zhì)量分析的色譜質(zhì)譜在線方法，可以在核酸藥物的研發(fā)分析和實(shí)時(shí)生產(chǎn)檢測(cè)中，更加有效、靈敏、快速和精確的測(cè)定寡聚核苷酸的分子質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 LTQ-Orbitrap Elite 組合式質(zhì)譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質(zhì)量精度、超低的靈敏度和超大的動(dòng)態(tài)范圍，極大地完善和推動(dòng)了基因藥物的鑒定分析。