優(yōu)化色譜質(zhì)譜參數(shù)獲得理想的單抗輕重鏈分子質(zhì)量

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

Q-Exactive；單抗藥物；輕重鏈分子質(zhì)量

 

現(xiàn)在，越來越多的生物制藥公司開始使用 Orbitrap 類型的質(zhì)譜進(jìn)行單抗藥物的表征分析，包括完整分子質(zhì)量、輕重鏈分子質(zhì)量、肽圖、糖鏈、二硫鍵、宿主蛋白殘留等等�；�于分子質(zhì)量測定的方法更加快速和直接，尤其是通過單抗輕重鏈分子質(zhì)量測定的方法，不僅可以得到分子質(zhì)量的信息，而且可以獲得和輕重鏈相關(guān)的二硫鍵信息、部分氨基酸后修飾位點(diǎn)的信息，糖基化結(jié)合位置的信息、ADC 結(jié)合位置的信息等等，同時，相對于完整分子質(zhì)量的分析，單抗輕重鏈分子質(zhì)量測定可以幫助客戶獲得更加細(xì)化和準(zhǔn)確的信息。在實(shí)際樣品分析的過程中，我們可以通過優(yōu)化色譜分離條件、質(zhì)譜分析條件來獲得最佳的輕重鏈分子質(zhì)量譜圖和相關(guān)信息。

 

目前，基于 Orbitrap 類型的 Q-Exactive 系列、LTQ-Orbitrap 系列、Orbitrap-Fusion 系列的質(zhì)譜儀器都可以進(jìn)行各種類型的單抗表征分析，在這里我們以 Q-Exactive plus 儀器為測試平臺，進(jìn)行了單抗輕重鏈分子質(zhì)量分析的色譜和質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，相似的參數(shù)可以直接應(yīng)用到其它基于 Orbitrap 類型的質(zhì)譜儀器上，為生物制藥客戶的實(shí)際樣品分析提供了參考依據(jù)。

 

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive plus（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Dionex 3000 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Agilent Zorbax 300，SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，DTT（Sigma-Aldrich）。

 

1 mg/mL 的 Herceptin 及其脫糖形式的單抗溶液，在保證 DTT 終濃度 20 mM 的條件下，37℃ 反應(yīng) 2 小時，然后直接用于后續(xù)色譜質(zhì)譜分析。

2.3 色譜質(zhì)譜分析方法

色譜分析條件：具體見表 1；

 

表 1. 輕重鏈分子質(zhì)量測定的色譜分析條件

 

（備注：該應(yīng)用報告中，使用了 2 種不同的色譜梯度，10 分鐘和 15 分鐘，括號中為 15 分鐘色譜梯度的設(shè)置參數(shù)。）

 

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 2. 輕重鏈分子質(zhì)量測定的質(zhì)譜分析條件

 

采用 Protein Deconvolution 4.0 軟件對原始質(zhì)譜圖進(jìn)行去卷積處理，幾個重要的參數(shù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，1）Target Mass：輕鏈為 23000 Da，重鏈為 46000 Da；2）Minimum Adjacent Charge：6 to 10；3）Mass Tolerance：20 ppm；4）Noise Rejection：99% confidence；5）m/z range：根據(jù)原始質(zhì)譜圖中的信號分布進(jìn)行調(diào)整；6）Output Mass Range：根據(jù) target mass 進(jìn)行調(diào)整，最后得到單抗輕重鏈去卷積后的分子質(zhì)量信息。

 

影響蛋白分子量測定的因素有很多，包括：流動相、溶液體系（不揮發(fā)性鹽）、雜質(zhì)成分、樣品濃度、pH 值、樣品在源內(nèi)分解或碎裂、質(zhì)譜分辨率等情況。在單抗輕重鏈測定的過程中，我們也會考慮到這些因素，一般我們選用 0.1% 甲酸的水溶液和 0.1% 甲酸的乙腈溶液作為流動相；如果單抗原溶液中含有不揮發(fā)性鹽，我們建議進(jìn)行脫鹽處理，比如說使用超濾管脫鹽，同時如果含有 SDS、Tween 等表面活性劑或者去垢劑最好也進(jìn)行超濾或者使用其它表面活性劑和去垢劑去除試劑盒進(jìn)行去除；如果含有雜質(zhì)成分，也需要根據(jù)雜質(zhì)的組成和性質(zhì)進(jìn)行雜質(zhì)去除；樣品的濃度不能太低，否則信噪比低，造成質(zhì)量誤差增大。以上這些參數(shù)主要同樣品前處理相關(guān)，需要作樣人員在質(zhì)譜分析前進(jìn)行前處理制備。而對于在質(zhì)譜分析中，可以調(diào)節(jié)的參數(shù)主要是源內(nèi)碎裂能量（SID），在這里我們就一起探討一下該參數(shù)對輕重鏈分子質(zhì)量的影響。

 

詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)如表 2 所示，源內(nèi)碎裂能量（SID）使用 0/30/50/70 和 100 eV 五個不同的電壓參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，輕鏈的原始質(zhì)譜圖如圖 1 所示，重鏈的原始質(zhì)譜圖如圖 2 所示，從圖 1 和圖 2 中，我們可以看到，隨著 SID 能量的增加，輕重鏈的質(zhì)荷比分布向高質(zhì)量端移動，并且在 70 eV 的時候發(fā)生了顯著的質(zhì)荷比移動和信噪比的降低，這主要是由于施加的電壓增大，輕重鏈發(fā)生降解的可能性增多，以致質(zhì)譜峰信噪比降低，峰強(qiáng)度降低，而輕鏈相對分子量比較小，比較簡單，因此信號改變不是很明顯，但對于重鏈，我們可以很明顯的觀察到這個現(xiàn)象。因此在實(shí)際樣品的測試中，考慮到信噪比和強(qiáng)度這兩個重要的因素，我們可以在 0–50 eV 的電壓值下進(jìn)行優(yōu)化（當(dāng)然也不排除樣品特殊的情況下，我們也可以提高 SID 值進(jìn)行優(yōu)化），在 Herceptin 樣品的測試中，我們選擇 30 eV 進(jìn)行后續(xù)的樣品采集和進(jìn)一步的色譜條件優(yōu)化。

 

圖 1. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的單抗輕鏈原始質(zhì)譜圖（SID 代表源內(nèi)碎裂能量，右上角的數(shù)字代表峰強(qiáng)度）

 

 

圖 2. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的單抗重鏈原始質(zhì)譜圖（SID 代表源內(nèi)碎裂能量，右上角的數(shù)字代表峰強(qiáng)度）

 

3.2 液相色譜梯度的優(yōu)化

在樣品初步測試的過程中，我們使用 10 分鐘的色譜梯度進(jìn)行樣品測試，得到的 LC-MS 色譜質(zhì)譜圖如圖 3 所示，可以看到輕重鏈在同一個色譜峰中出峰，沒有實(shí)現(xiàn)完全的分離，不過從質(zhì)譜圖中可以看到，色譜峰的前半部分為輕鏈，后半部分為重鏈，可以實(shí)現(xiàn)輕重鏈的分子質(zhì)量測定。在不考慮時間限制的情況下，可以適當(dāng)?shù)难娱L色譜梯度，實(shí)現(xiàn)輕重鏈的完全分離，如圖 4 所示，輕重鏈的色譜洗脫梯度主要在乙腈相 20%–50%，延長該段時間到 5 分鐘，延長總色譜梯度時間到 15 分鐘，就可以實(shí)現(xiàn)輕重鏈的完全分離。

 

圖 3. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 10 分鐘色譜梯度的單抗輕重鏈色譜質(zhì)譜圖

 

圖4 Q-Exactive質(zhì)譜采集的15分鐘色譜梯度的單抗輕重鏈色譜質(zhì)譜圖

 

 

基于以上的色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化，以 SID 為 30 eV 和色譜時間為 15 min，完整和脫糖 Herceptin 的輕鏈 LC-MS 以及原始質(zhì)譜圖如圖 5 所示，相應(yīng)的去卷積質(zhì)譜鏡像圖如圖 6 所示，可以看到輕鏈的平均分子質(zhì)量為 23438 Da；相應(yīng)的重鏈 LC-MS 以及原始質(zhì)譜圖如圖 7 所示，相應(yīng)的去卷積質(zhì)譜鏡像圖如圖 8 所示，可以看到脫糖重鏈的平均分子質(zhì)量為 49149 Da，完整 Herceptin 的糖型主要存在形式為 2G0F 和 G0F+G1F。

 

圖 5. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的輕鏈色譜質(zhì)譜圖

 

圖 6. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的輕鏈去卷積分子質(zhì)量鏡像圖

 

圖 7. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的重鏈色譜質(zhì)譜圖

 

圖 8. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的重鏈去卷積分子質(zhì)量鏡像圖

 

本文基于 Q-Exactive plus 質(zhì)譜平臺，主要優(yōu)化了源內(nèi)碎裂能量（SID）這一質(zhì)譜參數(shù)和色譜洗脫梯度，從而實(shí)現(xiàn)了單抗輕重鏈有效的色譜分離和高信噪比的質(zhì)譜測定，為藥物開發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)檢過程中的單抗輕重鏈分析提供了直接的實(shí)驗(yàn)方法，同時相似的質(zhì)譜參數(shù)也可以應(yīng)用到其它基于 Orbitrap 類型的質(zhì)譜儀器上，為廣大的生物制藥客戶提供了單抗樣品輕重鏈快速分析的參考依據(jù)。