化合物結(jié)構(gòu)鑒定：UHPLC 聯(lián)用Q Exactive Focus分析霉酚酸酯的降解產(chǎn)物

引言
強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂靖鞣N環(huán)境因素對(duì)原料藥和制劑的影響。它能提供藥品安全信息、確定推薦儲(chǔ)存條件、保質(zhì)期和分析方法的特異性。而降解產(chǎn)物的信息能幫助改進(jìn)化合物或配方的發(fā)展。霉酚酸酯（MMF）的商標(biāo)名稱(chēng)為驍悉（CellCept），是一種免疫抑制劑和霉酚酸（MPA）的前體藥物。MMF 廣泛的應(yīng)用在治療器官移植排異反應(yīng)和自體免疫疾病的移植藥物中，為本研究選擇的模型化合物。

本文采用高分辨臺(tái)式質(zhì)譜儀 Q Exactive Focus 開(kāi)發(fā)了一種快速可靠的分析霉酚酸酯降解產(chǎn)物的完整工作流程，采用HRAM全掃描和數(shù)據(jù)依賴(lài) MS/MS 在高分辨率和極性切換模式下實(shí)現(xiàn)降解產(chǎn)物的快速鑒定。HRAM MS 和 MS/MS 譜圖以及正/負(fù)離子模式切換，能可靠完成降解產(chǎn)物的定性和結(jié)構(gòu)鑒定。

實(shí)驗(yàn)方法

液相色譜方法
UHPLC：Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC
色譜柱：Thermo Dionex Acclaim 2.1×150 柱 , 2.2 µm
柱溫：35 ℃，流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣體積：1 µL
流動(dòng)相：A -0.1% 甲酸水溶液
        B - 含 0.1% 甲酸的乙腈
梯度洗脫：
        0-0.5 min 保持 20% B，然后在 15 min 內(nèi)線(xiàn)性增加到 40%B

質(zhì)譜方法
質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive Focus 臺(tái)式高分辨質(zhì)譜儀
HESI-II 離子源： ESI 正 / 負(fù)離子切換
全掃描采集：m/z 120-1000 amu，分辨率為 70,000（FWHM@m/z 200）
MS/MS 采集：17,500 分辨率下數(shù)據(jù)依賴(lài)采集，HCD 歸一化
碰撞能：35%，25% 階梯變化

樣品前處理方法
• 霉酚酸酯儲(chǔ)備液，濃度為 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，稱(chēng)取25mg標(biāo)準(zhǔn)品配制在10 mL乙腈中。
• 鹽酸（0.01 N，pH 2），乙酸銨（5 mM，pH 6），氫氧化鈉（0.01N，pH 8）和過(guò)氧化氫（3%，pH 8.2）。購(gòu)買(mǎi)的 30% 過(guò)氧化氫用水稀釋 10 倍后用于酸、堿和氧化研究。用氫氧化銨或乙酸調(diào)節(jié)強(qiáng)制降解溶液 pH 值。
• 用如上 pH 2、pH 6、pH 8 的溶液和過(guò)氧化氫（3%，pH 8.2）將濃度為 2.5 mg/mL 的霉酚酸酯儲(chǔ)備液稀釋 10 倍配制濃度為0.25 mg/mL 的強(qiáng)制降解溶液。強(qiáng)制降解溶液放置于60℃烘箱中。在放置的第 1、20、48 和 72 小時(shí)分別取樣，直接進(jìn)樣到 LC/MS 中進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)與討論
圖 1.MMF在pH 2.0和60℃條件下反應(yīng)1、20、48和72小時(shí)的總離子流色譜圖
1.UHPLC- 高分辨率 MS 快速測(cè)定降解產(chǎn)物采用 UHPLC- 高分辨率 MS 快速分析降解產(chǎn)物。高質(zhì)量的HRMS 全掃描圖譜為測(cè)定降解產(chǎn)物的元素組成提供了重要信息，并從隨后的數(shù)據(jù)依賴(lài) MS/MS 獲得分子離子的裂解信息。