Pepfinder軟件對(duì)單克隆抗體進(jìn)行肽圖分析

張曉夕1, Sutton, Jennifer N.2

1 賽默飛世爾科技（中國）有限公司

2 Thermo Fisher Scientific, West Palm Beach, FL, USA

 

在蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的質(zhì)控要求中，肽圖分析是其中重要的一環(huán)。肽圖分析包括對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行確證及相關(guān)修飾的鑒定和定量。根據(jù)蛋白藥物質(zhì)譜分析特點(diǎn)和生物制藥應(yīng)用的特殊需求，Thermo Fisher與Amgen聯(lián)合開發(fā)了PepFinderTM 軟件。

 

PepFinder不僅具有最基本的肽段序列確證、覆蓋率分析、修飾位點(diǎn)鑒定與定量、二硫鍵分析、圖譜對(duì)比和肽段CID/HCD/ETD譜圖解析等功能，還具有其獨(dú)特功能，如未知修飾搜索功能和氨基酸突變搜索功能[1-5]。這兩項(xiàng)功能可以幫助分析人員快速發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的序列突變，從而大大降低出現(xiàn)質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)的幾率。同時(shí)，PepFinder還有更多實(shí)用的功能設(shè)計(jì)，如內(nèi)置CHO細(xì)胞系糖型、具有肽段鑒定可信度評(píng)價(jià)功能，還可根據(jù)碎裂方式和能量智能預(yù)測(cè)多肽的理論碎裂譜圖，并用于與實(shí)驗(yàn)圖譜直觀對(duì)比，以輔助分析。這些功能不但減少工作強(qiáng)度，也降低了對(duì)分析員理解質(zhì)譜數(shù)據(jù)深度的要求。對(duì)于氨基酸固定修飾設(shè)置，不同于其它類似軟件（固定修飾只可精確至某一類氨基酸），在PepFinder中，可以精確到特定的某個(gè)氨基酸位點(diǎn)。 此功能對(duì)于蛋白藥的某些特殊分析需求提供了極大的便利。

 

 

圖1顯示了PepFinder搜庫得到的序列覆蓋度結(jié)果，圖中不同顏色代表信號(hào)強(qiáng)度。從圖中可以看出，單抗標(biāo)準(zhǔn)品的輕重鏈覆蓋度均達(dá)到了100%；PepFinder還可對(duì)脫酰胺進(jìn)行定量，這對(duì)于生物醫(yī)藥分析人員是非常有用的。圖2顯示了PepFinder生成的修飾情況總結(jié)；圖3展示了一條包含脫酰胺修飾肽段SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK的定性以及定量情況。

 

在PepFinder軟件的2.0版本中，加入了De Novo（從頭測(cè)序，指對(duì)于沒有蛋白序列的物種，根據(jù)質(zhì)譜碎片信息利用生物信息學(xué)計(jì)算，對(duì)序列重新拼接和組裝，以得到蛋白序列的技術(shù)）功能，可對(duì)所有肽段進(jìn)行De Novo Sequencing（圖4），或單獨(dú)對(duì)某一張MS/MS譜圖對(duì)應(yīng)的肽段進(jìn)行De Novo Sequencing（圖5）。

 

在PepFinder2.0軟件中，新增了 mgf格式文件輸出功能，供MASCOT用戶進(jìn)行HCP分析；還新增了Pinpoint txt文件輸出功能，供Pinpoint用戶進(jìn)行蛋白絕對(duì)定量；方便生物制藥用戶使用不同軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，大大減少工作人員在數(shù)據(jù)處理上耗費(fèi)的時(shí)間和精力。

 

從圖3中可以看出，使用PepFinder軟件可獲得連續(xù)的肽段碎片離子，提高了鑒定結(jié)果的可靠性；分別對(duì)N416和N429兩個(gè)可能發(fā)生脫酰胺修飾的位點(diǎn)進(jìn)行定量，可以得到N416的脫酰胺比例為2.28%，N429的脫酰胺比例為2.90%。對(duì)于生物醫(yī)藥行業(yè)分析人員，脫酰胺修飾量的變化是藥物穩(wěn)定性測(cè)試的重要參數(shù)，PepFinder軟件可提供精確到位點(diǎn)的脫酰胺定量信息，為分析人員提供有力參考。

 

在PepFinder軟件中，只要導(dǎo)入單克隆抗體的序列，即可自動(dòng)計(jì)算出該抗體的重鏈末端K丟失后分子量、還原后（未還原）輕/重鏈分子量、無糖/脫糖重鏈分子量和各種常見糖型重鏈分子量等（圖6）；目前，此功能為PepFinder軟件獨(dú)有，其他類似軟件尚無此功能。

 

PepFinder軟件還可對(duì)二級(jí)譜圖進(jìn)行預(yù)測(cè)，在類似軟件中，PepFinder軟件預(yù)測(cè)得到的二級(jí)譜圖最接近真實(shí)碎裂的譜圖（圖7）。

 

 

圖1 PepFinder序列覆蓋度結(jié)果

 

 

圖2 PepFinder生成的修飾情況總結(jié)

 

 

圖3 肽段SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK的脫酰胺鑒定及定量

 

 

圖4 在PepFinder2.0中對(duì)所有肽段進(jìn)行De Novo Sequencing

 

 

圖5 對(duì)一張MS/MS譜圖進(jìn)行De Novo Sequencing

 

 

 

圖6 在PepFinder軟件中計(jì)算單克隆抗體各種常用分子量

 

 

圖7 PepFinder軟件預(yù)測(cè)的二級(jí)譜圖與實(shí)測(cè)二級(jí)譜圖的對(duì)比。上，預(yù)測(cè)二級(jí)譜圖；下，實(shí)測(cè)二級(jí)譜圖。

 

在本文中，我們展示了PepFinder軟件對(duì)單克隆抗體進(jìn)行常規(guī)肽圖分析的各種應(yīng)用。結(jié)果表明，使用PepFinder軟件可以簡便快捷的得到序列覆蓋度分析的結(jié)果，并且可以對(duì)脫酰胺等生物醫(yī)藥質(zhì)控中重要的翻譯后修飾進(jìn)行鑒定以及定量。PepFinder獨(dú)具的單克隆抗體分子量計(jì)算功能及二級(jí)譜圖智能預(yù)測(cè)功能大大減少了分析人員花費(fèi)在數(shù)據(jù)處理上的時(shí)間；在PepFinder2.0版本中，新增的De Novo Sequencing功能和mgf格式文件、pinpoint txt文件輸出功能幫助分析人員對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行不同平臺(tái)上的深入挖掘。通過生成快速、全面的肽段表征及自動(dòng)化的修飾位點(diǎn)總結(jié)報(bào)告， PepFinder 軟件能夠大幅減少生物產(chǎn)品詳細(xì)表征所需的時(shí)間和精力。

 

1. Z. Zhang, Automated Precursor Ion Exclusion During LC/MS/MS Data Acquisition for Optimal Ion Identification, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23(8), 1400-1407.

2. Z. Zhang, Large-scale Identification and Quantification of Covalent Modifications in Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 2009, 81(20),8354-8364.

3. Z. Zhang and J. S. Mcelvain, Optimizing spectroscopic signal-to-noise ratio in analysis of data collected by a chromatographic /spectroscopic system, Anal. Chem. 1999, 71(1),39-45.

4. Z. Zhang and A. G. Marshall, A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray-to-charge ratio spectra, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998, 9, 225-233.

5. Z. Zhang, Retention time alignment of LC/MS data by a divide-and-conquer algorithm, J. Am.Soc. Mass Spectrom. 2012, 23(4), 764-772.

6. SC. Kim, Y. Chen, S. Mirza, et.al. A clean, more efficient method for in-solution digestion of protein mixtures without detergent or urea. J Proteome Res. 2006 Dec;5(12):3446-52.