Q Exactive HF 一小時(shí) DDA 鑒定 DIA 定量 4000 個(gè) Hela 蛋白

周岳；張偉

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

QE HF；DDA；DIA；Hela；蛋白質(zhì)鑒定；定量蛋白質(zhì)組學(xué)

 

數(shù)據(jù)非依賴性的掃描模式（data-independent acquisition, DIA）是近幾年來發(fā)展的一種新的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式[1]。它的理念是用二級(jí)碎片離子進(jìn)行蛋白相對(duì)/絕對(duì)定量。DIA 掃描模式中，超高分辨質(zhì)譜對(duì)特定質(zhì)量范圍內(nèi)的所有母離子進(jìn)行碎裂，采集所有母離子的碎片離子，并快速地依次掃描相鄰的母離子寬口內(nèi)的所有碎片離子。DIA 的數(shù)據(jù)中包含了所有碎片離子的保留時(shí)間和強(qiáng)度信息。用非常小的質(zhì)量偏差寬口（如 10 ppm）目標(biāo)性地抽提同一肽段的多個(gè)子離子，計(jì)算子離子的強(qiáng)度，就能對(duì)該肽段進(jìn)行鑒定和定量。DIA 定量相比傳統(tǒng)的基于母離子強(qiáng)度的 DDA 定量有選擇性好，定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[1]，所以 DIA 成為定量蛋白組學(xué)新的發(fā)展方向。

 

Q Exactive HF 是賽默飛世爾科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新靜電場(chǎng)軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀（圖 1）[2,3]。Q Exactive HF 采用了分段式四極桿技術(shù)（Advanced Quadrupole Technology，AQT）使離子傳輸效率至少提高了 2 倍；超高場(chǎng) Orbitrap 技術(shù)，提高了 Orbitrap 掃描速度，在 15000 分辨率時(shí)，二級(jí)譜圖的掃描速度是 20 Hz。這兩項(xiàng)技術(shù)提高了 QE HF 進(jìn)行 DDA、DIA 數(shù)據(jù)的采集能力。本文用 1 小時(shí)快速色譜梯度對(duì) QE HF 的 DDA 鑒定能力和 DIA 定量能力進(jìn)行考察，同時(shí)從定量肽段數(shù)目和 CV 兩方面對(duì) DDA 定量和 DIA 定量能力進(jìn)行比較。

 

Pierce HeLa Protein Digest Standard（貨號(hào)：88329），稀釋至 500 ng/μl，EASY-nLC 進(jìn)樣 1μl，500 ng進(jìn)行 DDA、DIA 數(shù)據(jù)采集，每種采集模式重復(fù) 3 遍。

 

高效液相色譜分離

高效液相色譜儀：EASY-nLC 1000 (Thermo ScientificTM)

分析柱：實(shí)驗(yàn)室自制 C18, 15 cm, ID 75 μm, 3 μm

流動(dòng)相：A： 0.1% 甲酸水溶液； B：0.1% 甲酸乙腈溶液

梯度：60 min, 3/0 – 6/2 – 22/48 – 40/53 – 80/55 – 80/60（%B/min）

流速：300 nL/min

 

DDA 數(shù)據(jù)采集：

質(zhì)譜儀：Q Exactive HF (Thermo ScientificTM)；

離子源：NanoFlex 離子源；離子模式：正離子；

噴霧電壓：1.8 kV；毛細(xì)管溫度：275℃；S-Lens RF：55%；

分辨率：一級(jí) 120000@m/z 200，二級(jí) 15000@m/z 200；一級(jí) AGC：3e6，Maximum IT：50ms；

碰撞能量：NCE 27%；Fixed first mass: 110 m/z

DIA數(shù)據(jù)采集：

質(zhì)譜儀：Q Exactive HF (Thermo ScientificTM)；

離子源：NanoFlex 離子源；離子模式：正離子；

噴霧電壓：1.8 kV；毛細(xì)管溫度：275℃；S-Lens RF：55%；

目標(biāo) m/z 窗口：400–1000；isolation window: 12Da；

碰撞能量：27%；fixed first mass: 200 m/z；AGC target: 1e6；

Maximum ion injection time: atuo；loop count: 50

 

Proteome Discoverer 蛋白鑒定流程：人蛋白數(shù)據(jù)庫（uniprot human_201309），母離子質(zhì)量偏差: 10 ppm；碎片離子質(zhì)量

 

偏差：0.02 Da；固定修飾：半胱氨酸烷基化（+57.021 Da）；動(dòng)態(tài)修飾：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺脫氨基化（+0.984 Da）；酶：trypsin；漏切位點(diǎn)：2；FDR < 0.01

 

Skyline DDA、DIA 蛋白定量流程：DDA 定量用 skyline MS1 filtering 功能，對(duì)每個(gè)肽段強(qiáng)度最高的 3 個(gè)母離子同位素峰進(jìn)行抽提，idotp _ 0.8；DIA 定量用 skyline DIA 功能，設(shè)置隔離窗口 12 Da，對(duì)給個(gè)肽段強(qiáng)度最高的 5 個(gè)子離子進(jìn)行峰抽提，mProphet 打分，控制 FDR < 0.01。

 

 

圖 1. DDA 定量和 DIA 定量實(shí)驗(yàn)流程

 

500 ng Hela 細(xì)胞裂解液進(jìn)行 3 次 1 h 梯度 DDA 分析，Proteome Discoverer 1.4 數(shù)據(jù)庫檢索。將鑒定到的蛋白和肽段信息導(dǎo)入 skyline 作為候選定量蛋白和肽段�；�于母離子的定量用 skyline 中 MS1 filtering 功能對(duì) DDA 數(shù)據(jù)進(jìn)行母離子強(qiáng)度抽提。500 ng Hela 細(xì)胞裂解液進(jìn)行 3 次目標(biāo) m/z 窗口 400–1000，隔離窗口 12 Da 的 DIA 分析�；�于二級(jí)子離子的定量用 skyline DIA 功能對(duì)子離子進(jìn)行峰抽提，mProphet 打分，篩選 Q value < 0.01 的肽段為定量肽段。

 

在分析 DIA 數(shù)據(jù)之前，需要建立譜圖庫，譜圖庫中包含所有蛋白在質(zhì)譜中鑒定到的肽段，以及肽段的保留時(shí)間、碎片離子質(zhì)荷比、碎片離子強(qiáng)度等信息。數(shù)據(jù)依賴性掃描是最好的建立譜圖庫的數(shù)據(jù)采集方式。500 ng Hela 細(xì)胞裂解液進(jìn)行三次 DDA 數(shù)據(jù)采集。原始數(shù)據(jù)經(jīng) Proteome Discoverer 檢索并控制 FDR < 1%。將三次 DDA 鑒定結(jié)果合并，導(dǎo)入 skyline 建立譜圖庫。DDA 數(shù)據(jù)除了能給出蛋白和肽段的鑒定信息，還能基于母離子的強(qiáng)度/峰面積進(jìn)行定量。Skyline 中 MS1 filtering 功能對(duì)母離子的多個(gè)同位素峰進(jìn)行抽提，并且根據(jù)同位素分布進(jìn)行打分（idotp 值）[4]。Idotp 代表測(cè)定的同位分布和理論同位素分布的相似度。篩選 idotp 值大于 0.8 的母離子作為可信的定量肽段。

 

500 ng Hela 細(xì)胞裂解液用相同的色譜柱，相同的色譜梯度，將 QE HF 切換至 DIA 掃描模式進(jìn)行 3 次 DIA 數(shù)據(jù)采集。在一次掃描循環(huán)中，目標(biāo)母離子質(zhì)核比范圍 400–1000，四極桿的隔離窗口為 12 Da，包含 50 次 MS/MS 掃描。每一張 MS/MS 譜圖中包含了 12 Da 窗口內(nèi)的所有母離子的碎片離子信息。QE HF 使用了超高場(chǎng)的 Orbitrap，掃描速度是 20 Hz，所以每次循環(huán)所用的時(shí)間約為 2.4–3 s，與色譜兼容（圖 2）。Skyline 處理 DIA 數(shù)據(jù)時(shí)從譜圖庫中選取強(qiáng)度最高的多個(gè)碎片離子進(jìn)行色譜峰抽提。Skyline 中嵌入的 mProphet 軟件會(huì)根據(jù)同一肽段的多個(gè)子離子峰的 feature 進(jìn)行打分。Feature 包括子離子共流出峰形、保留時(shí)間偏差、dotp 值、信噪比等。為了區(qū)分假陽性的子離子峰，mProphet 可以建立 decoy 庫，也可以將打分排名第二的肽段作為 decoy，計(jì)算 FDR[5,6]。篩選 FDR < 0.01 的肽段段作為可信的定量肽段（圖 1）。

 

 

圖 2. QE HF 掃描目標(biāo)質(zhì)核比窗口 400–1000 采集 50 張 MS/MS 所需時(shí)間在 2.4–3 s

 

500 ng Hela 細(xì)胞進(jìn)行 60 min 色譜梯度進(jìn)行 DDA 數(shù)據(jù)采集。在 60 min 內(nèi)，三次重復(fù)，QE HF 分別采集到 49065、49031、48885 張譜圖，鑒定到 22030、21820、21654 個(gè)肽段，對(duì)應(yīng)到約 3909、3900、3878 個(gè)蛋白。將三次的肽段和蛋白合并，一共鑒定到 32446 個(gè)肽段，4510 個(gè)蛋白（圖 3）。蛋白和肽段鑒定結(jié)果導(dǎo)入 skyline 建立譜圖庫。通過該譜圖庫，在 skyline 中建立需定量的候選肽段和蛋白。為了提高蛋白定量的準(zhǔn)確性，在 skyline 中設(shè)置一些肽段的限制條件，m/z 400–1000，母離子電荷 2+– 4+，無漏切位點(diǎn)。32446 個(gè)肽段中符合這些條件的肽段有 29686 個(gè)，對(duì)應(yīng) 4296 個(gè)蛋白。在 DDA 定量實(shí)驗(yàn)中，為每個(gè)候選肽段添加強(qiáng)度最高的 3 個(gè)同位素峰（M、M+1、M+2）作為定量離子，共生成 89027 個(gè)定量離子。在 DIA 定量實(shí)驗(yàn)中，為每個(gè)肽段添加 5 個(gè)強(qiáng)度最高的子離子（b3-bn，y3-yn）,共生成 145736 個(gè)定量離子。

 

 

圖 3. 500 ng Hela 細(xì)胞裂解液 3 次 DDA 鑒定結(jié)果（A）鑒定到的蛋白交蓋圖（B）鑒定到的肽段的交蓋圖

 

對(duì)于 DDA 定量，skyline 會(huì)從 DDA 數(shù)據(jù)一級(jí)譜圖中進(jìn)行母離子同位素峰抽提。篩選同位素分布與理論同位素分布較好的肽段作為可靠的定量肽段，即 idotp > 0.8。由于 DDA、DIA 實(shí)驗(yàn)中用的是相同的色譜梯度，DDA 實(shí)驗(yàn)中肽段的保留時(shí)間信息可以傳遞給 DIA 實(shí)驗(yàn)。所以在 DIA 定量時(shí)，限制 skyline 只抽提該肽段譜庫中保留時(shí)間 5 min 范圍內(nèi)的子離子。通過保留時(shí)間限制可以降低 DIA 數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜度和提高定量的準(zhǔn)確度。同時(shí)篩選 Q value < 0.01 的肽段最為可靠的定量肽段。

 

三次 DDA 實(shí)驗(yàn)從一級(jí)譜圖中分別定量到 25214、25515、24873 個(gè)肽段；3969、3975、3917 個(gè)蛋白；定量到的肽段占總候選肽段的 84%；峰面積的 CV 值在 20% 以下的占總定量肽段的 58.81%；CV 值在 10% 以下的占 25.25%（圖 4）。三次 DIA 定量分別定量到 27558、27604、27483 個(gè)肽段；4067、4080、4073 個(gè)蛋白。定量到的肽段張總候選肽段的 93%；峰面積的 CV 值在 20% 以下的占總定量肽段的 90.3%；CV 值在 10% 以下的占 69.01%（圖 5）�？梢钥闯� DIA 能夠定量到更多的肽段，而且定量肽段的峰面積 CV 值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 DDA。

 

 

圖 4. 3 次 DDA 實(shí)驗(yàn)和 3 次 DIA 實(shí)驗(yàn)定量到的肽段和蛋白

 

 

圖 5. DDA 定量和 DIA 定量母離子和子離子峰面積 CV

 

DDA 一般用于蛋白/肽段鑒定，同時(shí)可以基于母離子進(jìn)行的定量，在非常復(fù)雜的基質(zhì)中，非常容易受到其他肽段的干擾，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確，CV 值過大。DIA 定量是基于二級(jí)子離子的定量，用子離子定量會(huì)提高定量的選擇性，降低其他肽段的干擾，定量會(huì)比基于一級(jí)峰面積的定量更加準(zhǔn)確， CV 值較小。該實(shí)驗(yàn)中，用 500 ng Hela 細(xì)胞裂解液評(píng)價(jià) DDA 定量和 DIA 定量能力。3 次 DDA 實(shí)驗(yàn)鑒定到 32446 個(gè)肽段，4510 個(gè)蛋白。將鑒定到的蛋白和肽段導(dǎo)入 skyline 建立譜圖庫，篩選出 4296 個(gè)候選定量蛋白，29686 個(gè)候選定量肽段，作為 DDA 和 DIA 共同定量目標(biāo)。DDA 定量到了 84% 的肽段，92% 的蛋白；而 DIA 定量到了 93% 的肽段，95% 的蛋白。DIA 比 DDA 能定量到更多的肽段和蛋白，同時(shí) DIA 定量子離子峰面積的 CV 遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 DDA 定量母離子峰面積的 CV。結(jié)果表明，基于二級(jí)子離子的定量要由于基于一級(jí)母離子的定量。

 

QE HF 在一小時(shí)梯度內(nèi)就能從 500 ng Hela 細(xì)胞裂解液鑒定并定量 4000 個(gè)蛋白，這得益于 QE HF 較好的離子傳輸效率，超快的掃描速度。目前 DIA 定量基于一維反向色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析還不適用于二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。但是可以通過延長一維反向色譜的梯度，提高分離效率達(dá)到細(xì)胞蛋白質(zhì)組的全覆蓋。Matthais Mann 研究小組 2014 年用一維反向色譜在小鼠 NSC-34 和 N2a 細(xì)胞裂解液 240 min 色譜圖梯度，就鑒定到了 8000 多蛋白，基本上達(dá)到細(xì)胞系蛋白組全覆蓋[7]。通過 DDA 鑒定肽段蛋白，建立譜圖庫，DIA 進(jìn)行蛋白定量可能成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)新的發(fā)展方向。

 

1. Gillet, L C. et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics, 2012, 11(6): O111 016717.

2. Kelstrup, C D. et al. Rapid and deep proteomes by faster sequencing on a benchtop quadrupole ultra-high-field orbitrap mass spectrometer. J Proteome Res, 2014, 13(12):6187-6195.

3. Scheltema R A. et al. The Q Exactive HF, a benchtop mass spectrometer with a pre-filter, high performance quadrupole and an ultra-high field orbitrap analyzer. Mol Cell Proteomics, 2014, 13(12):3698-3708

4. Abbatiello S E. et al. Design, implementation, and multi-site evaluation of a system suitability protocol for the quantitative assessment of instrument performance in LC-MRM-MS. Mol Cell Proteomics, 2013, 12(9):2623-2639

5. Reiter, L. et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat. Methods.2011，8 (5):430-435

6. Röst H L. et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS-data. Nat. Biotechnol. 2014, 32(3):219-223

7. Horburg D. et al. Deep Proteomic Evaluation of Primary and Cell Line Motoneuron Disease Models Delineates Major Differences in Neuronal Characteristics. Mol Cell Proteomics, 2014, 13(12):3410-3420