精確修飾位點(diǎn)譜圖庫的建立與磷酸化蛋白質(zhì)組的 DIA 解析

張偉 周岳

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

翻譯后修飾；DIA；譜圖庫；磷酸化；定量蛋白質(zhì)組學(xué)

 

數(shù)據(jù)非依賴采集（Data-Independent Acquisition, DIA）是當(dāng)前最熱門的質(zhì)譜采集技術(shù)之一，它以非目標(biāo)的方式將質(zhì)量范圍分為若干窗口，依次并循環(huán)采集窗口內(nèi)所有母離子的二級碎片[1,2]。DIA 與 SRM 類似，也是基于子離子（transition）定量，相比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法具有更好的選擇性和更高的準(zhǔn)確度。然而，目前DIA在翻譯后修飾分析上仍有較大瓶頸。DIA 依賴于 DDA 建立譜圖庫，而 DDA 數(shù)據(jù)在搜庫鑒定時(shí)，修飾位點(diǎn)定位錯(cuò)誤的概率較高，特別是磷酸化修飾發(fā)生在常見的 S/T/Y 上，若肽段含有 2 個(gè)或以上位置接近的 S/T/Y，位點(diǎn)就容易找錯(cuò)。將含有錯(cuò)誤位點(diǎn)信息的鑒定結(jié)果作為譜圖庫，就會(huì)導(dǎo)致翻譯后修飾 DIA 解析結(jié)果的不可靠[3]。因此，DIA 尚難用于大規(guī)模的翻譯后修飾樣本分析。

 

針對修飾位點(diǎn)的打分算法使修飾位點(diǎn)的定位更加準(zhǔn)確，Proteome Discoverer 軟件中整合的 phosphoRS/ptmRS 模塊[4]和 MaxQuant 軟件的算法[5]都可以實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)可信度（Site Probability）的計(jì)算，從而獲得可靠的位點(diǎn)定位信息。本文基于上述軟件對翻譯后修飾 DDA 數(shù)據(jù)進(jìn)行位點(diǎn)可信度分析，篩選具有準(zhǔn)確位點(diǎn)定位的譜圖建立譜圖庫，導(dǎo)入 Skyline 軟件，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)可靠的翻譯后修飾 DIA 解析。將該流程應(yīng)用于磷酸化樣本 DIA 數(shù)據(jù)分析，成功提取 6401 條高可信度的磷酸化肽段（Q < 0.01），占譜圖庫肽段總數(shù)的 98.4%，其中可用于準(zhǔn)確定量的肽段（CV < 20%）占 86.9%，有效解決了翻譯后修飾 DIA 定量的難題。

 

來源于大鼠組織富集的磷酸化樣本，最終上樣量為 700 ng/run，分別進(jìn)行 DDA 和 DIA 采集，每種采集模式重復(fù) 3 遍。

 

納流高效液相色譜儀：EASY-nLC 1000（Thermo Scientific）

分析柱：納流 C18 色譜柱（長15cm, ID 75 μm, 粒徑3 μm）

流動(dòng)相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液

梯度：0–3 min, 3–7% B; 3–95 min, 7–22% B; 95–113 min, 22–35% B; 113–116 min, 35-90% B; 116-120 min, 90% B

流速：300 nL/min

 

質(zhì)譜儀：Orbitrap Fusion（Thermo Scientific）；

離子源：NanoFlex；離子模式：正離子；噴霧電壓：1.8 kV；毛細(xì)管溫度：275°C；S-Lens RF：60%

DDA：分辨率：一級120,000@m/z 200，二級30,000@m/z 200；AGC：一級2e5，二級5e4；二級Maximum Injection Time：100 ms；碰撞能量：HCD 30%

DIA：質(zhì)量范圍：m/z 400–1200；窗口：25 m/z（窗口間 1 m/z 重疊，實(shí)際 Isolation window 設(shè) 26 m/z）；二級分辨率：30,000@m/z 200；二級AGC：1e5；二級 Maximum Injection Time：85 ms；碰撞能量：HCD 30%；每個(gè) DIA 循環(huán)之間插入一次一級掃描。

 

基于 Proteome Discoverer 2.0 軟件進(jìn)行 DDA 鑒定、位點(diǎn)篩選和譜圖庫建立，Proteome Discoverer 1.4 和 MaxQuant 也可以實(shí)現(xiàn)相同的工作。

 

搜庫鑒定參數(shù)：Uniprot 大鼠蛋白數(shù)據(jù)庫，母離子質(zhì)量偏差：10 ppm；碎片離子質(zhì)量偏差：0.02 Da；固定修飾：C 烷基化（+57.021 Da）；動(dòng)態(tài)修飾：M 氧化（M+15.995 Da）；S/T/Y 磷酸化（S/T/Y+79.966 Da）；酶：trypsin；Q 值（Percolator）：< 0.01；ptmRS 模塊：PhosphoRS mode: True; Use diagnostic ions: True

 

位點(diǎn)篩選和譜圖庫建立：對 PSM 表格“Isoform Confidence Probability”一項(xiàng)進(jìn)行篩選，保留 _ 0.75 的結(jié)果，導(dǎo)成 PepXML 格式，并將相應(yīng)譜圖導(dǎo)成 mzML 格式。PepXML 文件和 mzML 文件同時(shí)導(dǎo)入 skyline 建立高可信磷酸化肽段譜圖庫。

 

DIA 數(shù)據(jù) Skyline 解析：根據(jù) DIA 采集參數(shù)設(shè)置隔離窗口，將譜圖庫中所有肽段及相應(yīng)蛋白作為 Targets，每個(gè)肽段選取強(qiáng)度最高的 6 個(gè) b/y 離子進(jìn)行峰抽提，提峰結(jié)果使用 mProphet 進(jìn)行假陽性評估，控制 Q 值 < 0.01。

 

 

由于肽段中含有多個(gè)可能發(fā)生翻譯后修飾的位點(diǎn)，如果不對可能發(fā)生修飾的位點(diǎn)進(jìn)行可信度打分，會(huì)造成翻譯后修飾位點(diǎn)的錯(cuò)誤匹配和定位。將錯(cuò)誤匹配和定位的翻譯后修飾肽段作為譜圖庫，就會(huì)導(dǎo)致 DIA 解析結(jié)果的錯(cuò)誤。這是目前翻譯后修飾 DIA 分析的瓶頸所在。

 

基于 Proteome Discoverer 的 phosphoRS/ptmRS 算法能夠?qū)�可能發(fā)生修飾的位點(diǎn)進(jìn)行打分（Site Probability），判斷定位的準(zhǔn)確性。通常認(rèn)為 Probability _ 75（100 分制）或 0.75（1 分制）的位點(diǎn)定位準(zhǔn)確、可靠；具有多個(gè)修飾位點(diǎn)的肽段，其所有位點(diǎn)的 Probability 均 _ 75（或 0.75），則修飾位點(diǎn)及 isoform 唯一確定。通過這一方法，篩選出位點(diǎn)準(zhǔn)確可信、isoform 唯一確定的 PSM（即 Isoform Confidence Probability  75（或0.75）建立譜圖庫，實(shí)現(xiàn)精確的翻譯后修飾 DIA 分析。整個(gè)流程如圖 1 所示。

 

 

圖 1. 精確修飾位點(diǎn)譜圖庫建立流程圖

 

磷酸化樣本信息和色譜質(zhì)譜參數(shù)見實(shí)驗(yàn)條件部分。3 針 DDA 數(shù)據(jù)按磷酸化檢索流程使用 Proteome Discoverer 2.0 軟件搜庫鑒定（S/T/Y+79.966 Da），并使用 ptmRS 模塊對位點(diǎn)打分（圖 2-1）。搜庫完成后，打開結(jié)果，使用 Filter 功能對 PSM 列表“Isoform Confidence Probability”項(xiàng)進(jìn)行篩選，保留得分大于等于 0.75 的 PSM（圖 2-2）。然后，點(diǎn)右鍵選擇”Check All-In This Table”，將符合條件的PSM選定。最后，在”Spectra”中導(dǎo)出mzML格式，在“To PepXML”中導(dǎo)出 PepXML 格式，并將兩個(gè)文件置于同一文件夾中，即可作為譜圖庫導(dǎo)入 Skyline（圖 2-3）。

 

 

圖 2. 翻譯后修飾 DDA 數(shù)據(jù)檢索、位點(diǎn)篩選和結(jié)果導(dǎo)出步驟

 

經(jīng) phosphoRS/ptmRS 計(jì)算得到每個(gè)磷酸化位點(diǎn)的打分（Site Probability），分?jǐn)?shù) > 75（或 0.75）則位點(diǎn)有確切的碎片支持，定位可靠。搜庫引擎沒有針對位點(diǎn)打分的功能，位點(diǎn)定位錯(cuò)誤概率大。圖 3 是一個(gè)典型的例子：RFSVTAEGGLTLEQVTDAR 肽段搜庫鑒定出包含 1 個(gè)磷酸化位點(diǎn)的多個(gè) PSM，3 號位絲氨酸和 5 號位蘇氨酸均有匹配到磷酸化發(fā)生（FDR < 1%）。而 ptmRS 的打分結(jié)果卻分 3 種情況：1) ptmRS 得到唯一可靠的位點(diǎn)，且與搜索引擎得到的位點(diǎn)一致，此時(shí) Isoform 100% 確定（圖 3-A）；2) ptmRS 得到兩個(gè)位點(diǎn)都有可能，無法確定唯一位點(diǎn)，此時(shí) Isoform 可靠度為 50%（圖 3-B）；3) ptmRS 得到唯一可靠的位點(diǎn)，但與搜索引擎得到的位點(diǎn)不一致，此時(shí) Isoform 可靠度為 0（圖 3-C）。最終，只篩選 Isoform打分（Isoform Confidence Probability）_ 75（或 0.75），即所有位點(diǎn)均明確、可靠的肽段建立譜圖庫。

 

 

圖3. 搜庫引擎/ptmRS結(jié)果一致、部分一致、不一致三種情況示例

 

實(shí)驗(yàn)共鑒定 56617 張 PSM（FDR < 1%），經(jīng)過 Isoform Confident Probability 篩選，共獲得 30558 張精確定位、isoform 唯一的磷酸化肽 PSM（圖 4），結(jié)果導(dǎo)成 mzML 和 PepXML 格式作為譜圖庫。

 

 

圖 4. Isoform Confident Probability 篩選前后 PSM 比較

 

將 mzML 和 PepXML 格式文件導(dǎo)入 Skyline 生成磷酸化肽譜圖庫，用于磷酸化肽段 DIA 數(shù)據(jù)解析。Skyline 將譜圖庫中所有肽段作為 targets 對 DIA 數(shù)據(jù)中進(jìn)行提峰，每條肽段選取 3 個(gè)母離子（單同位素, 單同位素 +1, 單同位素 +2）和 6 個(gè)響應(yīng)最高的 b/y 離子。提峰結(jié)果使用 mProphet 進(jìn)行假陽性評估，Q 值 < 0.01（即 FDR < 1%）為可信的提峰結(jié)果。

 

結(jié)果顯示，從 DIA 數(shù)據(jù)中提取、定量到 6401 條可信的磷酸化肽，占譜圖庫磷酸化肽總數(shù)（6505 條）的 98.4%（圖 5）。磷酸化肽的豐度和離子化效率普遍較低，本實(shí)驗(yàn)如此高的解析成功率表明，基于 Orbitrap 的 DIA 數(shù)據(jù)具有極高的譜圖質(zhì)量和出色的靈敏度。

 

 

圖5. DIA可靠解析的磷酸化肽占譜圖庫總數(shù)的98.4%

 

進(jìn)一步對 6401 條磷酸化肽 XIC 色譜峰面積的三針重現(xiàn)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將每條肽的母離子和子離子峰面積分別加和，選取兩者中重現(xiàn)性最好（即 CV 值最低）的結(jié)果用于定量。一般認(rèn)為，峰面積 CV 值 < 20% 時(shí)定量結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，峰面積 CV 值 < 20% 的磷酸化肽占總數(shù)的 86.9%（圖 6）。如此高的重現(xiàn)性說明 Orbitrap DIA 不僅具有出色的靈敏度，同時(shí)具有優(yōu)越的重現(xiàn)性，勝任復(fù)雜的翻譯后修飾定量。

 

 

圖 6. 磷酸化肽峰面積重現(xiàn)性（CV 值）統(tǒng)計(jì)

 

圖 7 展示了一個(gè)典型的磷酸化肽 DIA 解析結(jié)果。該磷酸化肽有 2 種異構(gòu)體，分別在 3 號位和 9 號位的絲氨酸上發(fā)生了磷酸化。得益于高質(zhì)量的 DIA 譜圖和嚴(yán)格的譜圖庫建立，即使這 2 種異構(gòu)體保留時(shí)間非常接近，也能成功、準(zhǔn)確地分辨。DIA 獲得的碎片豐度比與譜圖庫非常接近，匹配打分的 dotp 值均在 0.95 以上。

 

 

 

圖 7. 磷酸化肽異構(gòu)體在 DIA 中的分辨和匹配打分（dotp）

 

翻譯后修飾由于肽段上修飾位點(diǎn)的多重性和不確定性，難以獲得可靠的 DIA 結(jié)果，這一問題是 DIA 發(fā)展的瓶頸所在。另一方面，phosphoRS/ptmRS 和 MaxQuant 等算法和軟件的發(fā)展，使翻譯后修飾位點(diǎn)的 DDA 鑒定、定位更加準(zhǔn)確。本文基于上述算法和軟件對磷酸化樣本的 DDA 鑒定結(jié)果進(jìn)行位點(diǎn)打分，并篩選出位點(diǎn)定位準(zhǔn)確、可靠的譜圖建立譜圖庫用于 DIA 分析，成功從磷酸化樣本 DIA 數(shù)據(jù)中提取 6401 條可靠的磷酸化肽（Q < 0.01），占譜圖庫中磷酸化肽總數(shù)的 98.4%。其中，86.9% 的肽段峰面積 CV < 20%，可用于精確的磷酸化定量。該策略有效解決了翻譯后修飾 DIA 定量的難題，證明基于 Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜技術(shù)的 DIA 流程兼具出色的靈敏度和優(yōu)越的重現(xiàn)性，是復(fù)雜樣本定量特別是翻譯后修飾樣本定量的最佳選擇。

 

[1] Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline, Nat. Protoc., 2015, 10(6): 887-903

[2] Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues, Mol. Cell. Proteomics, 2015, 14(5): 1400-1410

[3] MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments, Mol. Cell. Proteomics, 2015, 14(9): 2405-2419

[4] Universal and confident phosphorylation site localization using phosphoRS, J. Proteome Res., 2011, 10(12): 5354-5362

[5] MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification, Nat. Biotechnol., 2008, 26(12): 1367-1372