賽默飛質(zhì)譜助您辨別“掛羊頭，賣狗肉”--利用 TSQ Quantiva 定量肉類摻假比例

丁小軍 顧培明 張偉 周岳 李靜

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

關(guān)鍵詞：肉類摻假；定量分析

 

“掛羊頭，賣狗肉”是日常用的一個熟語。雖然隨著時間的發(fā)展，這句話已經(jīng)難以反應(yīng)最真實的情況，在世界上大部分地方，狗已經(jīng)不作為食用肉的來源，即使在極少數(shù)食狗肉的地方，狗肉的價格也往往比羊肉還高，已經(jīng)失去了造假的意義。但是，這種商品標(biāo)識與實際商品的組成不一致的情況，卻是長期存在的。自從 2013 年歐盟“馬肉風(fēng)波”之后，中國肉類摻假的現(xiàn)象也屢見報道，進(jìn)一步加深了人們對肉類真實性的擔(dān)憂。這種非標(biāo)明的添加，極大的擾亂的市場次序，影響相關(guān)宗教人士、特殊風(fēng)俗與部分肉類禁食人士的情感與健康，也帶來了潛在致病性和疾病控制的難題。目前最常用檢測的方法有：基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR），和基于抗體抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫法（ELISA）。前者受到 DNA 降解，復(fù)雜基質(zhì)的干擾和樣品提取與擴(kuò)增方法的影響，干擾了定性和定量的準(zhǔn)確性。后者往往受制于抗體的制備，加工過程中蛋白變性，復(fù)雜基質(zhì)和近親緣種屬之間同源干擾導(dǎo)致的假陽性的影響 [1, 2]。

 

隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的成熟，大規(guī)模的定性和定量研究蛋白表達(dá)譜的技術(shù)已經(jīng)很成熟。因此，利用質(zhì)譜技術(shù)尋找不同肉類樣品特征性蛋白或者多肽，并進(jìn)行定量，能夠避免現(xiàn)在最常用的 PCR 技術(shù)和 ELISA 所面臨的上面的種種問題，其優(yōu)點包括：不受食品加工的過程影響，因為氨基酸序列比核酸序列在加工過程中更容易保存；同時實現(xiàn)定性與定量，避免假陽性且定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；能夠同時監(jiān)測多種添假 [2]。

 

豬肉，禽肉，牛肉和羊肉是世界上消耗量最大的四種肉類 [3]。大多數(shù)情況下，羊肉最貴，可能比最便宜的禽肉貴到 5 倍以上，在實際生活中，對不法商人具有最大的摻假誘惑力。我們基于超高分辨的 Q Exactive 質(zhì)譜平臺，研究了五種常見肉類彼此之間的特征性專屬多肽。選取其中找到的部分多肽，通過人為的將幾種不同的肉類進(jìn)行混合研究，模擬現(xiàn)實中摻假的情況，用 TSQ Qμantiva 建立了基于 SRM（Selected Reaction Monitoring）的摻假比例定量方法。整個實驗流程如下（圖 1）：

 

 

 

圖 1. 基于 Thermo 質(zhì)譜平臺肉類真實性解決方案。（A：樣品裂解； B：肉類裂解樣品還原烷化酶切；C：高分辨質(zhì)譜平臺采集每個物種數(shù)據(jù)；D：Proteome Discoverer 2.0，SEIVE 2.0 軟件尋找物種特征性多肽，Pinpoint 軟件批量自動生成定量離子對；E：TSQ Quantiva 定量分析）

 

本實驗所用肉類樣品牛肉，豬肉，雞肉和鴨肉購自于上海某大型超市，羊肉購自于上海某羊肉專賣店。五種肉類樣品分別去皮與脂肪取純肌肉樣品約 100 mg，用 RIPA 裂解液裂解后丙酮沉淀，尿素溶解后取部分測濃度，剩余樣品還原烷化，酶切過夜，固相萃取除鹽，離心濃縮后用 0.1%FA 溶解后備用。

 

將雞與鴨的裂解液等比例混合，取羊 1 μg 總蛋白酶切產(chǎn)物六份，分別添加雞和鴨的裂解酶切產(chǎn)物 1 μg、100 ng、10 ng、5 ng、1 ng、0.1 ng，模擬不同比例的摻假樣品，每份樣品進(jìn)樣三次。

 

液相 RSLC U3000 ，流速 0.2 mL/min，流動相 A 相為 0.1% FA/H₂O，流動相 B 相為 0.1% FA/ACN。色譜柱 Accucore-150-C18，100mm*2.1mm。梯度條件為：

 

表 1. 色譜梯度

 

質(zhì)譜離子源參數(shù)設(shè)置為：噴霧電壓 3500 V，鞘氣 38 Arb，輔氣 15 Arb，反吹氣為 0 Arb，離子傳輸管溫度 275℃，離子源霧化溫度為 380℃。質(zhì)譜采集參數(shù)為：采集周期為 0.3 s， 碰撞氣為 1.5mTorr， Q1 和 Q3 分辨率都為 0.7，源內(nèi)裂解能量為 0。

 

種屬特征性多肽尋找驗證是肉類摻假實驗的關(guān)鍵點，因此我們通過高分辨的 Q Exactive 質(zhì)譜平臺，研究了常見的五種肉類。選出每個物種專屬性的多肽，去掉含有酶漏切位點的多肽，鑒定到各個物種相對于其他四種物種專屬性的多肽條數(shù)為：雞 339 條，鴨 125 條，豬 426 條，牛 337 條，羊 152 條。其中，雞和鴨都為鳥綱家禽類，羊、牛、豬為哺乳綱真獸亞綱動物，前兩者之間的進(jìn)化親緣關(guān)系更近，我們同時找到了雞和鴨相對其他三種獸類專屬性的多肽 336 條。Pep003 為來源于雞/鴨的特征性肽段，圖 2 為利用 TSQ Quantiva 在不同摻假比例的樣本中定量 Pep003 的 XIC（eXtracted Ion Chromatogram）圖：

 

 

圖 2. TSQ Quantiva 在不同摻假比例的樣本中定量 Pep003 的 XIC 圖

 

依據(jù)豐度信息，我們選取了六條雞與鴨的特征性多肽（不含漏切位點，不含甲硫氨酸，不含 NXS/T 的糖基化基序），導(dǎo)入 Pinpoint 軟件，利用 Pinpoint 軟件自動導(dǎo)出離子對與碰撞能量信息，先采集一遍樣品的信息，利用 Pinpoint 軟件生成 schedule 信息，導(dǎo)入儀器自動生成最后的采集方法。方法中的離子對信息見下表：

 

表 2. 定量離子對和 Schedule 信息

 

 

通過將雞肉與鴨肉按不同比例摻加到 1 μg 的羊肉中，利用 SRM 的方法，定量研究能夠檢測到的最低摻比比例，并利用 Xcalibur 定量模塊對上面的多肽分別進(jìn)行定量，確定線性范圍。其中 Pep001 和 Pep003 都能夠定量到 5 ng 的最低摻假，剩下的四條能夠定量到 10 ng 摻假。即分別能夠檢測到 0.5% 比例的摻假和 1% 比例摻假，實際標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍如下：

 

 

圖 3. 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

 

QED（Qualitative Enhanced Data）掃描功能是指通過監(jiān)測 SRM 實時采集信號，利用二級子離子強(qiáng)度觸發(fā)，采集對應(yīng)母離子二級碎裂全掃描譜圖，在定量的同時，獲得更確切的定性信息的功能。通過 QED 技術(shù)，我們采集了 Pep003 的 QED 質(zhì)譜圖，圖 4 為理論多肽 Pep003 實際譜圖與理論 b、y 離子匹配結(jié)果：

 

 

圖 4. Pep003 的 QED 全掃描子離子圖

 

在發(fā)現(xiàn)性研究中，文獻(xiàn)中報導(dǎo)的 6 條豬專屬性多肽 [4-6]，我們只找到了其中的一條，還有兩條是單氨基酸突變，另外三條沒有找到；文獻(xiàn)中報導(dǎo)的 21 條雞專屬性多肽我們找到了 17 條 [6, 7]，其中有一條文獻(xiàn)報道有乙�；�修飾，而我們檢索過程沒有加這個修飾�，F(xiàn)代家豬由野豬馴化而來，經(jīng)過了約 9000 年的長期的馴化與飼養(yǎng)過程中，亞種間和亞種內(nèi)核型都發(fā)生了很大的差異，不同的地域或者品系的豬在蛋白表達(dá)上都有極大的差異 [8]；而單氨基酸多態(tài)性（Single amino acid polymorphism，SAP）是自然界普遍存在的現(xiàn)象，地域和個體差異都能造成這種結(jié)果�；�于上面的這些信息，由于動物基因型的差別，以及樣品處理過程帶來的影響，每一個物種僅選擇一條多肽進(jìn)行定量，很有可能造成大面積的假陰性的檢出結(jié)果，有必要提高每個物種監(jiān)測的多肽的數(shù)目，降低假陰性的概率。

 

雞與鴨作為常見的肉食性禽類，相對其他三種肉類來說，親緣關(guān)系要更近一些，而且我們確實發(fā)現(xiàn)，它們共有的特異性多肽的條數(shù)（336條）甚至大于我們找到的鴨特異性多肽的條數(shù)（125條）。通過這種方式，還能夠部分的彌補(bǔ)很多物種蛋白數(shù)據(jù)庫不完善的情況（鴨的蛋白數(shù)據(jù)庫就不全）。同時，雞鴨同時共有而又相對獸類特異的多肽，往往也增加了其他禽類共有的可能性，一定程度上更經(jīng)濟(jì)的部分實現(xiàn)一些未知禽類物種添加的可能性。

 

我們基于賽默飛全方位的質(zhì)譜解決方案，建立了從摻假的發(fā)現(xiàn)，到定量多肽的選擇，以及定量的實現(xiàn)的完整流程，并對發(fā)現(xiàn)的部分多肽進(jìn)行了摻假實驗與定量能力考察�；�于實驗結(jié)果，對于每一個物種，我們應(yīng)該同時監(jiān)測盡可能多的多肽，盡量避免假陰性的結(jié)果。我們同時選取雞和鴨的六條特征性多肽，同時對兩種禽類肉摻假進(jìn)行了監(jiān)測，并確定了最低的摻假監(jiān)測限為 0.5%。考慮到摻假比例的經(jīng)濟(jì)性與可操作性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了實際監(jiān)測的需求。

與傳統(tǒng)的基于 PCR 和抗體的檢測方法相比，質(zhì)譜具有大致相當(dāng)?shù)撵`敏度，但是擁有更好的避免假陰性與假陽性的結(jié)果的能力，且能夠避免由于加工所帶來的 PCR 或者抗體相關(guān)的空間結(jié)構(gòu)破壞所帶來的影響。

 

與上述摻假相比，還有一種相對來說，更為嚴(yán)重，性質(zhì)更惡劣的摻假——病死肉的摻假�；�于上述的思路，我們認(rèn)為，通過進(jìn)一步系統(tǒng)的研究，質(zhì)譜也能夠成為一種監(jiān)測病死肉的手段，斬斷病死肉流入餐桌的魔爪，與我們?nèi)�方位的農(nóng)殘篩查與檢測手段一起，為食品安全提供全方位的保障。同時，利用這種研究方法，我們還能助力有機(jī)肉類產(chǎn)品生產(chǎn)商，提供從肉類良種選擇依據(jù)到肉類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的可能性。

 

1.Nakyinsige, K., Y.B. Man, and A.Q. Sazili, Halal authenticity issues in meat and meat products. Meat Sci, 2012. 91(3): p. 207-14.

2.Sentandreu, M.A. and E. Sentandreu, Peptide biomarkers as a way to determine meat authenticity. Meat Sci, 2011. 89(3): p. 280-5.

3.http://www.fao.org/ag/againfo/themes/en/meat/background.html.

4.von Bargen, C., et al., New sensitive high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of horse and pork in halal beef. J Agric Food Chem, 2013. 61(49): p. 11986-94.

5.von Bargen, C., J. Brockmeyer, and H.U. Humpf, Meat authentication: a new HPLC-MS/MS based method for the fast and sensitive detection of horse and pork in highly processed food. J Agric Food Chem,2014. 62(39): p. 9428-35.

6.Montowska, M., et al., Rapid detection of peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal Chem, 2014. 86(20): p. 10257-65.

7.Sentandreu, M.A., et al., A proteomic-based approach for detection of chicken in meat mixes. J Proteome Res, 2010. 9(7): p. 3374-83.

8.Ramos-Onsins, S.E., et al., Mining the pig genome to investigate the domestication process. Heredity (Edinb), 2014. 113(6): p. 471-84.