UHPLC和高分辨率臺式質(zhì)譜儀聯(lián)用分析霉酚酸酯的降解產(chǎn)物

前言

強制降解實驗?zāi)芙沂靖鞣N環(huán)境因素對原料藥和制劑的影響。它能提供藥品安全信息、確定推薦儲存條件、保質(zhì)期和分析方法的特異性。而降解產(chǎn)物的信息能幫助改進(jìn)化合物或配方的發(fā)展。

霉酚酸酯（MMF）的商標(biāo)名稱為驍悉（CellCept），是一種免疫抑制劑和霉酚酸（MPA）的前體藥物。 MMF 廣
泛的應(yīng)用在治療器官移植排異反應(yīng)和自體免疫疾病的移植藥物中。本研究選擇 MMF 作為模型化合物。

本文開發(fā)了一種快速可靠的分析霉酚酸酯降解產(chǎn)物的完整工作流程，使用的儀器是賽默飛世爾科技的 Accela^TM
UHPLC 系統(tǒng)和臺式 Orbitrap Q Exactive FocusTM 質(zhì)譜儀，數(shù)據(jù)處理采用 Mass FrontierTM 軟件。霉酚酸酯在熱和過氧化物催化下的降解研究的 pH 值設(shè)定為 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2。采用 HRAM 全掃描和數(shù)據(jù)依賴MS/MS 在高分辨率和極性切換模式下實現(xiàn)降解產(chǎn)物的快速鑒定。 HRAM MS 和 MS/MS 譜圖以及正 / 負(fù)離子模式切換，能可靠完成降解產(chǎn)物的定性和結(jié)構(gòu)鑒定。

實驗方法

材料與試劑

霉酚酸酯 API CAS# 128794-94-5 購自 2A PharmaChem（Lisle， IL），純度 >98%。
霉酚酸酯降解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品
霉酚酸， CAS# 24280-93-1 Sigma-Aldrich。
霉酚酸酯雜質(zhì) G， CAS# 224052-51-1， Molcan Corporation，加拿大多倫多
霉酚酸酯雜質(zhì) A， CAS# 1322681-36-6， Molcan Corporation，加拿大多倫多
鹽酸、乙酸銨、氫氧化鈉和過氧化氫購自 Sigma-Aldrich。

樣品前處理

● 霉酚酸酯儲備液，濃度為 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，稱取 25 mg 標(biāo)準(zhǔn)品配制在 10 mL 乙腈中。
● 鹽酸（0.01 N， pH 2），乙酸銨（5 mM， pH 6），氫氧化鈉（0.01 N， pH 8）和過氧化氫（3%， pH 8.2）。購買的 30% 過氧化氫用水稀釋 10 倍后用于酸、堿和氧化研究。用氫氧化銨或乙酸調(diào)節(jié)強制降解溶液 pH 值。
● 用如上 pH 2、 pH 6、 pH 8 的溶液和過氧化氫（3%， pH 8.2）將濃度為 2.5 mg/mL 的霉酚酸酯儲備液稀釋 10倍配制濃度為 0.25 mg/mL 的強制降解溶液。強制降解溶液放置于 60℃烘箱中。在放置的第 1、 20、 48 和 72小時分別取樣，直接進(jìn)樣到 LC/MS 中進(jìn)行分析。

HPLC 方法

HPLC 系統(tǒng)： Thermo Scientific Accela 1250 pump, Open Accela Autosampler and Accela PDA
色譜柱： Thermo Scientific Dionex Acclaim 2.1×150 柱 , 2.2 μm
柱溫箱溫度： 35℃
流動相：A - 0.1% 甲酸水溶液
            B – 含 0.1% 甲酸的乙腈
            C - 100 mM 甲酸銨的水溶液（pH 5）
梯度洗脫： 0-0.5 min 保持 20% B，然后在 15 min 內(nèi)線性增加到 40%B
流速： 500 μL/min
進(jìn)樣體積： 1 μL

質(zhì)譜方法

質(zhì)譜儀： Thermo Scientific Q Exactive Focus 臺式高分辨質(zhì)譜
儀，配備 HESI-II 離子源
離子化模式： ESI 正 / 負(fù)離子切換
全掃描采集： m/z 120-1000 amu，分辨率為 70,000（FMHW@m/z 200）
MS/MS 采集： 35,000 分辨率下響應(yīng)強度數(shù)據(jù)依賴采集
HCD 碰撞能量： 35%， 25% 階梯變化

結(jié)果與討論

I. UHPLC- 高分辨率 MS 快速測定降解產(chǎn)物

采用 UHPLC- 高分辨率 MS 快速分析降解產(chǎn)物。高質(zhì)量的 HRMS 全掃描圖譜為測定降解產(chǎn)物的元素組成提
供了重要信息，并從隨后的數(shù)據(jù)依賴 MS/MS 獲得分子離子的裂解信息。

II. 高分辨率 MS/MS 鑒定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

具備階梯式碰撞能量的高分辨高能碰撞解離功能產(chǎn)生了信息量豐富的碎片，能更輕松地完成降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定。

III. 極性切換功能全面鑒定降解產(chǎn)物

快速正 / 負(fù)離子切換實驗采用在正離子模式下完成一次全掃描，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴 MS2 HCD 裂解。隨后轉(zhuǎn)換到負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描和數(shù)據(jù)依賴 MS2 HCD 裂解。自動極性切換提供了不同但是互為補充的降解產(chǎn)物的裂解信息。這些獨特極性的碎片能幫助確認(rèn)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果（圖 6）。

結(jié)論

本文研究了霉酚酸酯 API 在 pH 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2 條件下的熱和過氧化氫降解。采用臺式高分辨率質(zhì)譜儀 Q Exactive Focus與 UHPLC 系統(tǒng)聯(lián)用快速準(zhǔn)確地分析了降解產(chǎn)物，見圖 1、 2 和 3。
● 高分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測定（HRAM）的全掃描圖譜實現(xiàn)了快速的鑒定 – 獲得降解產(chǎn)物元素組成的關(guān)鍵信息。
● 信息量豐富的高能量碰撞解離（HCD）MS/MS 圖譜有利于準(zhǔn)確鑒定降解產(chǎn)物。
● 全掃描和 MS/MS 模式下的正 / 負(fù)離子切換模式能全面鑒定降解產(chǎn)物，如圖 4 和 5 所示。
● 數(shù)據(jù)分析軟件 Mass Frontier 極大的提高了降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析的速度和可靠性。
Q Exactive Focus 臺式 Orbitrap MS 具有強大的功能，在一體化UHPLC/HR-MS/MS 平臺上快速高效地完成降解產(chǎn)物分析，從而顯著提高了藥物研發(fā)過程中降解產(chǎn)物的鑒定通量。

參考文獻(xiàn)

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