定量蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜采集技術(shù)進(jìn)展

張偉*

(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司, 上海201206)

 

摘要 質(zhì)譜是定量蛋白組學(xué)的主要工具。近年來(lái)隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入,傳統(tǒng)質(zhì)譜定量技術(shù)面臨著復(fù)雜基質(zhì)干擾、分析通量限制等諸多問(wèn)題。而最近一系列質(zhì)譜新技術(shù)的發(fā)展,包括同步母離子選擇(SPS)、質(zhì)量虧損標(biāo)記、平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)、多重累積(MSX)和多種全新數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)等,為解決目前蛋白質(zhì)組學(xué)在相對(duì)定量和絕對(duì)定量分析方面的局限提供了有效途徑。本文對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)目前遇到的瓶頸問(wèn)題進(jìn)行了分析,總結(jié)了質(zhì)譜定量采集技術(shù)的最新進(jìn)展,并評(píng)述了這些新技術(shù)的特點(diǎn)以及在定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)。

 

關(guān)鍵詞 定量蛋白質(zhì)組學(xué); 同步母離子選擇; 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè); 數(shù)據(jù)非依賴性采集; 綜述

 

 

當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)注焦點(diǎn)和研究趨勢(shì)已經(jīng)逐漸從定性分析轉(zhuǎn)向定量分析。定量蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)細(xì)胞、組織乃至完整生物體的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定量分析,對(duì)生物過(guò)程機(jī)理的探索和臨床診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證具有重要意義[1,2] 。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分為相對(duì)定量與絕對(duì)定量[3] 。相對(duì)定量即差異比較,通過(guò)質(zhì)譜大規(guī)模、高通量地對(duì)兩種或多種不同生理、病理?xiàng)l件下的樣本進(jìn)行定量分析,獲得蛋白質(zhì)表達(dá)量的精確差異,主要方法有穩(wěn)定同位素標(biāo)記和非標(biāo)記兩種技術(shù)手段[4,5] 。絕對(duì)定量即獲得蛋白的具體表達(dá)量,利用質(zhì)譜監(jiān)測(cè)目標(biāo)蛋白的專一性肽段(Unique Peptide)獲得色譜-質(zhì)譜峰面積,并與已知量的標(biāo)準(zhǔn)肽段(外標(biāo)法)或穩(wěn)定同位素標(biāo)記的重標(biāo)肽段(內(nèi)標(biāo)法)比較確定具體量,實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。主要質(zhì)譜方法是對(duì)專一性肽段進(jìn)行選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)或稱多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Selected/ Multiple reaction monitoring, SRM/ MRM)[6] 。

 

穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)定量的經(jīng)典方法。樣本在穩(wěn)定同位素標(biāo)記后、質(zhì)譜分析前混合,一次分析實(shí)現(xiàn)差異定量,有效消除了色譜和質(zhì)譜分離分析過(guò)程中的不穩(wěn)定性,最大程度減小了定量誤差。常見(jiàn)方法有基于代謝標(biāo)記的SILAC[7] 、基于酶解標(biāo)記的18 O 標(biāo)記[8] 和基于化學(xué)標(biāo)記的二甲基化[9] 等,這些方法通過(guò)一級(jí)母離子提取峰面積實(shí)現(xiàn)定量比較。但是,一級(jí)定量具有標(biāo)記通量低、動(dòng)態(tài)范圍差、靈敏度不高等不足,因此, 近年來(lái),基于同重同位素標(biāo)記的二級(jí)定量方法使用越來(lái)越廣泛[10] 。利用同重同位素標(biāo)簽標(biāo)記肽段,在一級(jí)質(zhì)譜不同樣本的肽段分子量沒(méi)有區(qū)分,相互疊加,提高了靈敏度;二級(jí)碎裂獲得分子量不同的報(bào)告離子,在b/ y 離子定性的同時(shí),通過(guò)報(bào)告離子之間的強(qiáng)度差異實(shí)現(xiàn)定量,提高了動(dòng)態(tài)范圍。同重同位素主要標(biāo)記試劑有iTRAQ[11] 和TMT[12] ,標(biāo)簽容量分別達(dá)到了8 標(biāo)和6 標(biāo)。然而,同重同位素標(biāo)記技術(shù)面臨共洗脫肽段干擾的問(wèn)題。蛋白質(zhì)組學(xué)樣本非常復(fù)雜,在色譜上存在大量共洗脫肽段,而質(zhì)譜在選擇母離子進(jìn)行二級(jí)分析時(shí),選擇窗口通常在m / z 2 左右,分子量接近的共洗脫肽段被同時(shí)選擇,碎裂出的報(bào)告離子與目標(biāo)肽段報(bào)告離子疊加,降低了定量比例的準(zhǔn)確性[13,14] 。Ting 等[15] 研究證明,在復(fù)雜樣本中,共洗脫肽段嚴(yán)重干擾了報(bào)告離子的強(qiáng)度,造成肽段和蛋白的定量比例低于真實(shí)比例,產(chǎn)生“低估效應(yīng)冶。這一問(wèn)題已成為同重同位素標(biāo)記定量技術(shù)的瓶頸。

 

基于三重四極桿的SRM(或稱MRM)是質(zhì)譜定量的金標(biāo)準(zhǔn),在蛋白質(zhì)絕對(duì)定量中也廣泛使用[6] 。SRM 根據(jù)專一性肽段的母離子質(zhì)量和子離子質(zhì)量,第一級(jí)質(zhì)量分析器(Q1)篩選母離子,進(jìn)入碰撞池碎裂后,第二級(jí)質(zhì)量分析器(Q3)再篩選子離子,最大程度地去除干擾離子,監(jiān)測(cè)母離子-子離子形成的離子對(duì)的信號(hào)響應(yīng)。通過(guò)外標(biāo)法,利用已知量的標(biāo)準(zhǔn)肽段繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線; 或內(nèi)標(biāo)法,直接加入已知量的同位素重標(biāo)肽段同時(shí)監(jiān)測(cè),從而實(shí)現(xiàn)定性確證和定量檢測(cè)[6,16] 。SRM 靈敏度高、線性范圍廣,是目標(biāo)蛋白驗(yàn)證和絕對(duì)定量的有效手段。然而,隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)的深入發(fā)展,樣本基質(zhì)越來(lái)越復(fù)雜、目標(biāo)蛋白豐度越來(lái)越低,容易受到高豐度蛋白的掩蓋。而SRM 由于質(zhì)量分辨率低,難以有效去除復(fù)雜基質(zhì)背景的干擾,易造成假陽(yáng)性[17,18] 。另一方面,隨著分析通量的要求越來(lái)越高,一次分析可能需要監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)離子對(duì),而SRM 速度和靈敏度的局限使得能同時(shí)監(jiān)測(cè)的離子對(duì)數(shù)量有限[19] ; 此外,離子對(duì)、碰撞能量等條件的優(yōu)化也費(fèi)時(shí)費(fèi)力,難以滿足目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)高通量發(fā)展的需要,特別是大樣本量的生物標(biāo)志物和系統(tǒng)生物學(xué)研究[20,21] 。因此,蛋白質(zhì)絕對(duì)定量同樣面臨著較大的技術(shù)挑戰(zhàn)。

 

近兩年來(lái),隨著以O(shè)rbitrap 為代表的高分辨質(zhì)譜硬件技術(shù)不斷進(jìn)步、采集方法不斷創(chuàng)新,定量蛋白質(zhì)組學(xué)遇到的諸多瓶頸正逐步得到解決。這些技術(shù)包括基于同重同位素標(biāo)記技術(shù)的同步母離子選擇和質(zhì)量虧損標(biāo)記,相對(duì)于傳統(tǒng)SRM 掃描的高分辨平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)和多重累積-平行反應(yīng)監(jiān)測(cè),以及多種全新數(shù)據(jù)非依賴性采集技術(shù)。

 

 

以iTRAQ 和TMT 為代表的同重同位素標(biāo)記技術(shù)面臨著兩方面的技術(shù)瓶頸:(1) 大量共洗脫肽段對(duì)定量準(zhǔn)確性的影響:分子量接近的共洗脫肽段與目標(biāo)肽段共同選擇并碎裂,報(bào)告離子疊加,造成實(shí)際定量比例不能準(zhǔn)確反映真實(shí)結(jié)果[13 ~15] ; (2) 等重同位素標(biāo)簽通量有限:以iTRAQ 為例,其報(bào)告基團(tuán)(N-methylpiperazine)由6 個(gè)C 和2 個(gè)N 組成,因此容量上限為8 標(biāo),無(wú)法完成更高通量樣本的分析[22] 。而通過(guò)增大報(bào)告基團(tuán)來(lái)提升標(biāo)簽容量又會(huì)造成靈敏度的下降[23] 。

 

為解決共洗脫肽段干擾的問(wèn)題,Ting 等[15] 使用LTQ-Orbitrap 進(jìn)行MS³ 掃描,對(duì)TMT 標(biāo)記的樣本進(jìn)行分析(圖1)。其中MS² 使用能量較低的CID (35%)碎裂,獲得b/ y 離子碎片用于序列鑒定,同時(shí)確保了TMT 標(biāo)簽不會(huì)過(guò)多碎裂。在母離子m / z 110 ~160% 的范圍內(nèi),選擇最強(qiáng)的一個(gè)碎片離子,進(jìn)行高能量HCD (60%)碎裂和MS3 檢測(cè),使報(bào)告基團(tuán)充分碎裂,獲得報(bào)告離子比例信息。結(jié)果表明,通過(guò)母離子和子離子雙重篩選,共洗脫肽段的干擾能夠被徹底去除,獲得的定量比例與理論比例一致。例如,在摻入等比例人源蛋白的不同比例酵母全蛋白樣本中,理論比值為10頤1,傳統(tǒng)MS² 測(cè)得的比值僅約為3,而MS³ 測(cè)的比值為11. 7,與理論比值非常接近。

 

但是與傳統(tǒng)MS² 方法相比,MS³ 信號(hào)強(qiáng)度明顯降低。因此,雖然MS³ 的定量準(zhǔn)確度大大提高,但定量靈敏度卻明顯下降,也使得MS³ 定量方法并沒(méi)有普遍應(yīng)用到實(shí)際分析中[24] 。此外,近來(lái)發(fā)展的TMT互補(bǔ)離子(TMTc) [25] 和QuantMode[26] 等技術(shù)雖然也能降低共洗脫肽段的干擾,但過(guò)程較為繁瑣,準(zhǔn)確度無(wú)法與MS³ 方法相媲美。

 

 

圖1MS³ 定量方法示意圖[15] :(A) MS³ 方法質(zhì)譜采集過(guò)程; (B) MS³ 與傳統(tǒng)MS² 方法結(jié)果對(duì)比

 

Fig. 1Schematic elucidation of MS³ method[15] : (A) Acquisition workflow of MS³ ; (B) Comparison of MS³ and classic MS² results.

 

同步母離子選擇(Synchronous precursor selection, SPS)技術(shù)的出現(xiàn)徹底解決了MS³ 響應(yīng)弱的問(wèn)題。SPS 技術(shù)利用多頻切跡的選擇波形電壓(MultiNotch) [27] ,在線性離子阱中實(shí)現(xiàn)一次選擇同時(shí)獲得多個(gè)離子,最多可同時(shí)選擇15 個(gè)(圖2A)。利用這一原理,SPS 技術(shù)在MS² 中同時(shí)選擇目標(biāo)肽段的多個(gè)b/ y碎片進(jìn)行MS³ 分析,產(chǎn)生的報(bào)告離子相累積,使MS3 信號(hào)響應(yīng)大幅提高(圖2B)[24,28] 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用SPS 進(jìn)行MS³ 定量分析,即二級(jí)CID 碎裂,并同時(shí)選擇多個(gè)碎片離子進(jìn)行三級(jí)HCD 碎裂和Orbi-trap 檢測(cè),獲得的MS³ 譜圖響應(yīng)與傳統(tǒng)MS2 譜圖相當(dāng),定量成功率超過(guò)70%,與傳統(tǒng)MS² 定量結(jié)果相當(dāng)(圖2C)[24,28] 。同時(shí),多個(gè)碎片報(bào)告基團(tuán)的疊加相比傳統(tǒng)MS³ 單個(gè)碎片報(bào)告基團(tuán),得到的比值更加穩(wěn)定,定量重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度進(jìn)一步增加(圖2D)。此外,相比傳統(tǒng)方法,MS³ 定量方法只能用于Lys-C 酶解樣品,SPS MS³ 定量方法適用于廣泛使用的Trypsin 酶解樣品,能更普遍用于常規(guī)定量蛋白質(zhì)組學(xué)[29] 。Weekes 等[30] 使用SPS MS³ 技術(shù)定量研究了巨細(xì)胞病毒(CMV)感染纖維母細(xì)胞的過(guò)程和機(jī)理,獲得超過(guò)8000 個(gè)蛋白(包括1184 個(gè)細(xì)胞表面蛋白)在8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)感染過(guò)程中的精確定量變化,實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)定量分析,開(kāi)創(chuàng)了定量時(shí)序病毒組學(xué)(Quantitative Temporal Viromics)領(lǐng)域的先河。

 

 

圖2 SPS MS³ 定量方法示意圖[24,28] :(A) SPS MS³ 方法質(zhì)譜采集過(guò)程; (B) 傳統(tǒng)MS² 、MS³ 、SPS MS³ 對(duì)報(bào)告離子的影響; (C) MS³ 、SPS MS³ 定量靈敏度對(duì)比; (D) 傳統(tǒng)MS² 、SPS MS³ 定量準(zhǔn)確度對(duì)比

 

Fig.2 Schematic elucidation of synchronous precursor selection (SPS) MS³ method [24, 28] :(A) Acquisition workflow of SPS MS³ ; (B) Influence of classic MS2 ,MS³and SPS MS³ for reporter ion intensity; (C) Comparison of sensitivity of MS³ and SPS MS³ ; (D) Comparison of accuracy of classic MS² and SPS MS³

 

對(duì)于同重同位素標(biāo)簽通量的限制,Dephoure 等[31] 嘗試使用3 標(biāo)SILAC 結(jié)合6 標(biāo)TMT,同時(shí)定量18 組平行樣本,取得了良好的效果。而近年來(lái),質(zhì)量虧損標(biāo)記技術(shù)的運(yùn)用,從根本上拓展了報(bào)告基團(tuán)的標(biāo)簽容量。¹³C 和¹²C、¹⁵N 和¹⁴N 之間因核結(jié)合能形成質(zhì)量虧損,巧妙利用¹³C¹⁴ N 與¹²C¹⁵N 之間6. 32 mDa的微小質(zhì)量差,通過(guò)¹³C 與¹⁵N 相互替換,即可實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽容量上限的突破(圖3A)。例如,將TMT 6 標(biāo)中TMT127、TMT129 報(bào)告基團(tuán)上一個(gè)¹³ C 替換成¹⁵ N,形成TMT127L (¹² C₈ H₁₆ ¹⁵N¹⁺ , 127. 1247608 Da) /TMT127H (¹²C₇¹³C₁H^₁₆14N¹⁺ , 127. 1310808 Da), TMT129L (¹²C₆¹³C₂H₁₆¹⁵N¹⁺ , 129. 1314705 Da) /TMT129H (¹²C5 ¹³C₃H^{16 14}N¹⁺ , 129. 1377904 Da),標(biāo)簽容量提升至8 標(biāo)[32] 。類似地,在不改變報(bào)告基團(tuán)結(jié)構(gòu)的情況下,TMT 10 標(biāo)、TMT 18 標(biāo)均得以實(shí)現(xiàn),有效解決了多組平行樣本的定量分析問(wèn)題[33, 34] 。但是另一方面,6.32 mDa 的質(zhì)量差異需要質(zhì)譜在m / z 100 ~200 范圍達(dá)到50000 以上的分辨率才能實(shí)現(xiàn)基線分辨(圖3B),普通高分辨質(zhì)譜難以勝任[33] 。而基于傅里葉變換原理的超高分辨Orbitrap 和FT-ICR,分辨率與m / z 成反比,能夠輕松分辨m / z 100 ~200 的質(zhì)量虧損標(biāo)簽[34] 。目前,基于質(zhì)量虧損標(biāo)記的TMT 10 標(biāo)已經(jīng)商品化,廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)生物學(xué)和臨床標(biāo)志物研究等大樣本量的定量蛋白質(zhì)組學(xué)(圖3C)。

 

 

圖3質(zhì)量虧損標(biāo)記提升標(biāo)簽通量[33] :(A) 質(zhì)量虧損標(biāo)記原理(TMT-10); (B) 區(qū)分6 mDa 所需的質(zhì)量分辨

率; (C) 質(zhì)量虧損報(bào)告離子質(zhì)譜示意圖(TMT-10)

 

Fig. 3Increasing labeling capacity by mass defect isotopes [33] :(A) Principle of mass defect labeling (TMT-10);(B) Minimum resolution for discrimination of 6 mDa mass difference; (C) Mass spectrum of mass defect reporter ions(TMT-10)

 

近年來(lái),以同步母離子選擇SPS 和質(zhì)量虧損標(biāo)記為代表的新技術(shù)的發(fā)展,使得傳統(tǒng)同重同位素標(biāo)記定量面臨的諸多問(wèn)題正逐步獲得解決,成為蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)定量的有力工具和發(fā)展趨勢(shì)。

 

 

SRM 使用低分辨四極桿進(jìn)行兩級(jí)離子篩選和監(jiān)測(cè),在小分子分析中能有效區(qū)分目標(biāo)化合物和基質(zhì)背景,因?yàn)樾》肿拥幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)通常差異較大[35] 。然而在蛋白質(zhì)組學(xué)中,由于肽段性質(zhì)的相似性,SRM 難以完全排除復(fù)雜樣本的背景離子,容易受到較大干擾,影響蛋白絕對(duì)定量的準(zhǔn)確性和專一性[17,18] 。此外,SRM 還需要花費(fèi)相當(dāng)?shù)木�力進(jìn)行離子對(duì)的選擇和優(yōu)化[36] 。質(zhì)譜技術(shù)的改進(jìn)也為SRM 帶來(lái)改善。高分辨SRM (H-SRM)將四極桿的母離子選擇窗口從傳統(tǒng)的m / z 0. 7 縮小到m / z 0. 2, 從而有效地降低基質(zhì)背景的干擾[37,38] 。然而,選擇窗口縮小也同時(shí)降低了選擇效率,因此該技術(shù)更多應(yīng)用于小分子分析。此外,通過(guò)增加第三級(jí)質(zhì)量篩選形成三級(jí)MRM (MRM3 )掃描,也有效提高了選擇性[39] 。但是MRM3 面臨著同樣的問(wèn)題,額外一級(jí)離子篩選降低了檢測(cè)靈敏度,同時(shí)也增加了循環(huán)時(shí)間。

 

四極桿-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和掃描速度的提升,為目標(biāo)蛋白定量提供了新的途徑。平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Parallel reaction monitoring, PRM)正是相對(duì)于傳統(tǒng)SRM 建立起來(lái)的高分辨離子監(jiān)測(cè)技術(shù)[40,41] 。PRM 基于以Q-Orbitrap 為代表四極桿-高分辨質(zhì)譜平臺(tái),與SRM 每次掃描一個(gè)Transition 不同,PRM 每次對(duì)一個(gè)母離子產(chǎn)生的所有Transition 進(jìn)行全掃描,即平行監(jiān)測(cè)了一個(gè)母離子對(duì)應(yīng)的所有離子對(duì)。首先,PRM 使用四極桿(Q1)選擇母離子,選擇窗口通常m / z 臆2; 然后,母離子在碰撞池(Q2)中碎裂,形成子離子; 最后,以O(shè)rbitrap 取代Q3,對(duì)所有子離子進(jìn)行高分辨/ 高質(zhì)量精度(HR/ AM)的全掃描,完成PRM 采集(圖4)[42] 。相比傳統(tǒng)的SRM,PRM 的優(yōu)勢(shì)在于:(1) 高分辨子離子監(jiān)測(cè),質(zhì)量精度達(dá)ppm 級(jí)(通常外標(biāo)法<3 ppm,內(nèi)標(biāo)法<1 ppm),在不損失靈敏度的情況下,最大程度地排除了背景干擾; (2)二級(jí)為全掃描,無(wú)需事先確定離子對(duì)和優(yōu)化碰撞能量,只需要在數(shù)據(jù)處理時(shí)選擇響應(yīng)最高的一個(gè)或幾個(gè)子離子,即可提取母子離子對(duì)的色譜峰進(jìn)行定量,線性范圍可達(dá)5 ~ 6 個(gè)數(shù)量級(jí); (3) 同時(shí)定性與定量分析,二級(jí)全掃描譜圖用于定性分析,選擇其中最佳的子離子提取離子對(duì)即可完成定量分析。

 

Peterson 等[40] 利用14 條標(biāo)準(zhǔn)肽段比較了SRM和PRM 兩種掃描方式的選擇性和靈敏度,結(jié)果表明在無(wú)基質(zhì)的情況下,SRM 和PRM 的定量限均能達(dá)到amol 級(jí); 而在酵母基質(zhì)中,PRM 的定量限仍保持在amol 級(jí),但SRM 的定量限只有fmol 級(jí),上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)(圖5A),SRM 離子對(duì)受到很大的基質(zhì)干擾(圖5B)。Gallien 等[42] 使用SRM 和PRM 考察了35 條重標(biāo)肽段的175 對(duì)離子對(duì)在尿液基質(zhì)中的最低定量限,結(jié)果表明,只有19% 的離子對(duì)其SRM 定量限低于PRM 定量限。近來(lái),PRM 逐漸應(yīng)用到生命科學(xué)研究中,Tsuchiya 等[43] 對(duì)野生型和UFD4 基因(泛素融合降解通路)敲除型細(xì)胞中脯氨酸-茁-半乳糖苷酶(Ub-茁-bgal)的泛素化進(jìn)行PRM 監(jiān)測(cè)和定量分析,研究?jī)煞N細(xì)胞中泛素鏈與蛋白連接位點(diǎn)的變化,證明了UFD4 與K29 型連接的泛素化密切相關(guān)。Tang 等[44] 利用PRM 驗(yàn)證了組蛋白H3 和H4 的甲基化、乙�；�、丙�；�等55 種修飾位點(diǎn),并對(duì)修飾程度進(jìn)行了定量分析,還發(fā)現(xiàn)了H3 K18 甲基化、H4 K20 乙�；�等諸多全新修飾位點(diǎn)。

 

 

圖4選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)SRM(A)與平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)PRM(B)原理[40]

Fig. 4Principle of selected reaction monitoring (SRM)

and parallel reaction monitoring (PRM) [40

 

 

圖5SRM/ PRM 靈敏度與選擇性比較[40] :(A) 多種肽段在無(wú)基質(zhì)和酵母基質(zhì)中的定量限比較; (B) 酵母基質(zhì)

中肽段GVSAFSTWEk 的提取離子流圖比較

 

Fig. 5Comparison of sensitivity and selectivity of SRM/ PRM [40] : (A) Comparison of LOQs of peptides in neat and yeast matrix. (B) Comparison of extracted ion chromatograms of peptide GVSAFSTWEk in yeast matrix

 

 

然而PRM 的分析通量不如SRM。PRM 能同時(shí)監(jiān)測(cè)最多10 ~15 個(gè)母離子,而SRM 能同時(shí)監(jiān)測(cè)上百個(gè)離子對(duì),因?yàn)楦叻直尜|(zhì)譜的有效掃描速度通常只有10 ~15 Hz,遠(yuǎn)慢于SRM 的有效掃描速度。但是這一問(wèn)題正逐步得到解決,多重累積(Multiplexing, MSX)技術(shù)的發(fā)展和使用有效提高了PRM 的分析通量。多重累積利用Orbitrap 前端的C 型阱(C-trap),不同質(zhì)量的母離子依次被四極桿選擇并儲(chǔ)存于C-trap 中,等待Orbitrap 完成上次掃描后,C-trap 中儲(chǔ)存的混合離子同時(shí)注入到Orbitrap 中進(jìn)行掃描,實(shí)現(xiàn)最多10 個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)監(jiān)測(cè),分析通量最高可提升10 倍[45] 。Gallien 等[46] 將多重累積與PRM 結(jié)合建立MSX-PRM 技術(shù),利用4 重累積和保留時(shí)間分段(1. 5 ~2. 5 min 窗口),在60 min 液相梯度下,定量監(jiān)測(cè)了酵母全蛋白裂解液中770 個(gè)目標(biāo)肽段,對(duì)應(yīng)436 種蛋白。其中,同一保留時(shí)間下的肽段數(shù)量最高達(dá)60 個(gè),在這種情況下,循環(huán)時(shí)間保持在2 s 以下,分析通量達(dá)到SRM 的水平。此外,通過(guò)優(yōu)化分辨率、離子注入時(shí)間等參數(shù),目標(biāo)肽段分析通量還能進(jìn)一步提高:在MSX 設(shè)為8 時(shí),同時(shí)監(jiān)測(cè)的肽段數(shù)量可達(dá)128 個(gè)[42,45] 。

 

綜上所述,高分辨PRM 和MSX-PRM 技術(shù)的出現(xiàn),解決了傳統(tǒng)SRM 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面存在的諸多不足,為復(fù)雜樣本中目標(biāo)蛋白的驗(yàn)證和絕對(duì)定量提供了有效手段。

 

 

基于數(shù)據(jù)依賴性采集(Data dependent acquisition, DDA)的鳥(niǎo)槍法(Shotgun)是蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典策略,也是蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)定量的主要技術(shù)手段。DDA 二級(jí)采集取決于一級(jí)掃描結(jié)果,易造成低豐度肽段的丟失,具有一定的隨機(jī)性,掃描點(diǎn)數(shù)也不均勻。而SRM 等目標(biāo)采集方法不能采集非目標(biāo)肽段,而且分析通量有限。近年來(lái)發(fā)展的數(shù)據(jù)非依賴性采集(Data independent acquisition, DIA)結(jié)合了DDA 與SRM 的特點(diǎn),將整個(gè)掃描范圍等分為若干窗口,每個(gè)窗口依次選擇、碎裂,采集窗口內(nèi)所有母離子的全部子離子信息。DIA 無(wú)需指定目標(biāo)肽段,通量無(wú)上限,掃描點(diǎn)數(shù)均勻,利用譜圖庫(kù)即可實(shí)現(xiàn)定性確證和定量離子篩選,同時(shí)數(shù)據(jù)可以回溯,相比傳統(tǒng)DDA 和SRM 具有明顯優(yōu)勢(shì)[47] 。

 

Venable 等[48] 使用線性離子阱(LTQ),以10 m / z 窗口步長(zhǎng)依次選擇、碎裂、采集,對(duì)15 N 標(biāo)記的酵母全蛋白樣品進(jìn)行相對(duì)定量分析,開(kāi)創(chuàng)了DIA 應(yīng)用的先河。結(jié)果表明,通過(guò)DIA 提取的色譜峰,其信噪比、重現(xiàn)性和定量準(zhǔn)確性均明顯優(yōu)于DDA,蛋白定量數(shù)量增加了87%。Gillet 等[49] 基于Q-TOF (Trip-leTOF),采用32 個(gè)連續(xù)的m / z 25 窗口建立SWATH 技術(shù),并證明SWATH 的選擇性與SRM 相當(dāng)。SWATH 的發(fā)展使DIA 越來(lái)越多地應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)[50 ~52] 。同時(shí),基于Q-Orbitrap (Q Exactive)的DIA 技術(shù),同樣使用25 m / z 步長(zhǎng),通過(guò)更高的分辨率,使復(fù)雜樣本定量的選擇性進(jìn)一步提高。此外,諸如MSE、AIF 等質(zhì)量范圍不分段的DIA 方法在蛋白定量中也有所應(yīng)用,但由于這些方法不進(jìn)行質(zhì)量分段選擇,而是將所有離子同時(shí)碎裂、檢測(cè),基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重,難以勝任復(fù)雜樣本的定量分析[49,53] 。

 

然而,由于掃描速度的限制,基于高分辨質(zhì)譜的DIA 通常需要以m / z 25 的大窗口步長(zhǎng)分段,以確保獲得足夠的掃描點(diǎn)數(shù)進(jìn)行定量。而m / z 25 的選擇窗口仍然會(huì)引入較多的干擾離子,影響DIA 的定量分析效果(圖6A)[54] 。

 

近來(lái),全新DIA 技術(shù)的發(fā)展使DIA 的選擇窗口不斷縮小,DIA 定量選擇性、靈敏度和重現(xiàn)性進(jìn)一步提高。其中,前文提到的多重累積技術(shù)已應(yīng)用到DIA 中,Egertson 等[54] 利用Q-Orbitrap 的多重累積功能發(fā)展了MSX-DIA 技術(shù),隨機(jī)將5 個(gè)m / z 4 窗口依次選擇、累積,然后同時(shí)注入Orbitrap 進(jìn)行掃描。MSX-DIA 總步長(zhǎng)仍然是m / z 20,不影響掃描速度,而m / z 20 由5 段獨(dú)立的窗口組成,實(shí)際選擇窗口僅m / z 4(圖6A)。數(shù)據(jù)利用Skyline 軟件去卷積,即可將每個(gè)碎片歸屬到特定窗口中,實(shí)現(xiàn)m / z 4 窗口的選擇性(圖6B)。MSX-DIA 的選擇性已接近DDA,最大程度減少了共流出肽段和雜質(zhì)的干擾。Q-OT-qIT 三合一質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為提高DIA 性能帶來(lái)了更多可能[55] 。利用Q-OT-qIT 中Orbitrap和線性離子阱互不干擾、平行工作的特點(diǎn),使Orbitrap 專門進(jìn)行一級(jí)掃描,線性離子阱專門進(jìn)行二級(jí)DIA 掃描,線性離子阱掃描速度達(dá)20 Hz,比高分辨掃描更快。然后,使用一級(jí)超高分辨譜圖進(jìn)行母離子色譜峰的精確提取和定量,二級(jí)譜圖只用于確證、不用于定量。因此,整體掃描速度明顯增加,同時(shí)二級(jí)DIA 掃描又無(wú)需關(guān)注掃描點(diǎn)數(shù),為進(jìn)一步縮小選擇窗口帶來(lái)可能。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 正是基于這種模式建立的DIA 技術(shù)(圖7)[56,57] 。WiSIM-DIA 將m / z 200 寬窗口一級(jí)選擇離子監(jiān)測(cè)掃描(Wide i-solation window-SIM)與m / z 12 窗口步長(zhǎng)的二級(jí)離子阱全掃描相結(jié)合,24 萬(wàn)分辨率的寬窗口SIM 掃描有效提高了母離子的選擇性,利用母離子精確質(zhì)量提取色譜峰進(jìn)行定量,相比經(jīng)典DIA 的子離子定量靈敏度更高(圖7A)。同時(shí),利用二級(jí)譜圖實(shí)現(xiàn)肽段定性確證。雖然與經(jīng)典DIA 相比,WiSIM-DIA 二級(jí)為低分辨譜圖,但選擇窗口從m / z 25 縮小到了m / z 12,能有效減少基質(zhì)背景的干擾。更進(jìn)一步,Full MS-DIA 以m / z 3 步長(zhǎng)進(jìn)行二級(jí)采集,并插入若干24 萬(wàn)分辨率的一級(jí)全掃描保證母離子掃描點(diǎn)數(shù),與WiSIM-DIA 一樣,利用一級(jí)母離子定量、二級(jí)子離子定性(圖7B)。值得注意的是,Full MS-DIA 將選擇窗口縮小到僅m / z 3,其選擇性與DDA 相當(dāng),數(shù)據(jù)可以直接作為低分辨譜圖(母離子依1. 5 Da 質(zhì)量精度)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,鑒定結(jié)果與DDA 高度吻合,首次使DIA 擺脫了依賴于譜圖庫(kù)的局限,初步實(shí)現(xiàn)了DIA與DDA 的統(tǒng)一[57] 。當(dāng)然,DIA 數(shù)據(jù)直接進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的算法和卡值方法也已出現(xiàn),很快就會(huì)應(yīng)用到DIA 中,從而使DIA 和DDA 一樣可以直接搜庫(kù)鑒定,徹底擺脫譜圖庫(kù)的限制,已有數(shù)據(jù)證明DIA 能夠獲得比DDA 更多的鑒定結(jié)果。

 

 

圖6DIA 與MSX-DIA 原理[54] :(A) DIA 與MSX-DIA 采集原理與比較; (B) MSX-DIA 譜圖通過(guò)去卷積歸屬獲得4 m / z 窗口譜圖

 

Fig. 6Schematic elucidation of data independent acquisition (DIA) and multiplexing-data independent acquisition (MSX-DIA)[54] : (A) Comparison of DIA and MSX-DIA; (B) Deconvolution of MSX-DIA spectra for 4 m / z selectivity

 

此外,最近發(fā)展的pSMART 技術(shù),利用m / z 5 步長(zhǎng)進(jìn)行二級(jí)Orbitrap 掃描,并在掃描范圍內(nèi)插入若干一級(jí)超高分辨Orbitrap 掃描,在Q-Orbitrap 平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了類似WiSIM-DIA 的采集技術(shù)[58] 。結(jié)果顯示,無(wú)論是定性還是定量分析,pSMART 的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性都要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)DIA。

 

無(wú)論是相對(duì)定量還是絕對(duì)定量方法,DIA很好地克服了DDA鳥(niǎo)槍法和SRM目標(biāo)監(jiān)測(cè)的種種不足, 在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中具有良好的應(yīng)用前景。然而,目前DIA 方法的循環(huán)時(shí)間仍然較長(zhǎng),只能與納流液相聯(lián)用,并使用較長(zhǎng)的梯度以獲得足夠的色譜峰寬,限制了DIA 的應(yīng)用范圍。這也是DIA 技術(shù)下一步需要解決的問(wèn)題。

 

 

圖7WiSIM-DIA 與Full MS-DIA 原理[57] :(A) WiSIM-DIA 采集原理; (B) Full MS-DIA 采集原理

Fig. 7Schematic elucidation of wide isolation-SIM (WiSIM)-DIA and Full MS-DIA[57] : (A) Workflow of WiSIM-DIA; (B) Workflow of Full MS-DIA

 

 

基于報(bào)告離子定量的同重同位素標(biāo)記、目標(biāo)離子監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)非依賴采集已成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)的主要技術(shù)手段,表1 總結(jié)和比較了這3 種方法的原理和異同。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展為質(zhì)譜技術(shù)帶來(lái)挑戰(zhàn),基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的相對(duì)定量和基于SRM 的絕對(duì)定量都面臨著復(fù)雜基質(zhì)的嚴(yán)重干擾和通量不足等局限(表1)。而近來(lái)一系列高分辨質(zhì)譜新技術(shù)的發(fā)展為解決這些問(wèn)題帶來(lái)希望。其中,同步母離子選擇和質(zhì)量虧損標(biāo)記有效解決了相對(duì)定量的干擾和通量問(wèn)題; 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)及多重累積技術(shù)提高了SRM 的選擇性,成為絕對(duì)定量的新途徑; 數(shù)據(jù)非依賴性采集兼具DDA 與SRM 的優(yōu)勢(shì),多重累積和三合一質(zhì)譜技術(shù)使DIA 的掃描步長(zhǎng)進(jìn)一步縮小,能更有效地使DIA 技術(shù)應(yīng)用于高通量的定量蛋白質(zhì)組學(xué)。未來(lái),這些新技術(shù)將逐漸取代傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù),越來(lái)越多地應(yīng)用到定量蛋白質(zhì)組學(xué)中,為解決諸如蛋白質(zhì)相互作用、臨床標(biāo)志物研究等領(lǐng)域最棘手的問(wèn)題帶來(lái)新的手段和突破。

 

表1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)的原理與進(jìn)展

Table 1 Principle and progress of quantitative proteomic methods

 

 

1 Ong S E, Mann M. Nat. Chem. Biol. , 2005, 1(5): 252-262

2 Veenstra T D. J. Chromatogr. B, 2007, 847(1): 3-11

3 ZHOU Yuan, SHAN Yi -Chu, ZHANG Li -Hua, ZHANG Yu -Kui. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(6):496-502

周愿, 單亦初, 張麗華, 張玉奎. 色譜, 2013, 31(6): 496-502

4 Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B. Anal. Bioanal. Chem. , 2007, 389(4): 1017-1031

5 ZHU Jin -Lei, ZHANG Kai, HE Xi -Wen, ZHANG Yu -Kui. Chinese J. Anal. Chem. , 2010, 38(3): 434-441

朱金蕾, 張鍇, 何錫文, 張玉奎. 分析化學(xué), 2010, 38(3): 434-441

6 Lange V, Picotti P, Domon B, Aebersold R. Mol. Syst. Biol. , 2008, 4: 222

7 Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Mol. Cell. Proteomics, 2002, 1(5):376-386

8 Capelo J L, Carreira R J, Fernandes L, Lodeiro C, Santos H M, Simal -Gandara J. Talanta, 2010, 80(4): 1476-1486

9 Boersema P J, Raijmakers R, Lemeer S, Mohammed S, Heck A J. Nat. Protoc. , 2009, 4(4): 484-494

10 Koehler C J, Strozynski M, Kozielski F, Treumann A, Thiede B. J. Proteome Res. , 2009, 8(9): 4333-4341

11 Thompson A, Schafer J, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neumann T, Johnstone R, Mohammed A K, Hamon C. Anal. Chem. , 2003, 75(8): 1895-1904

12 Ross PL, Huang Y N, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet -Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Mol. Cell. Proteomics, 2004,3(12): 1154-1169

13 Karp N A, Huber W, Sadowski P G, Charles P D, Hester S V, Lilley K S. Mol. Cell. Proteomics, 2010, 9(9):1885-1897

14 Ow S Y, Salim M, Noirel J, Evans C, Rehman I, Wright P C. J. Proteome Res. , 2009, 8(11): 5347-5355

15 Ting L, Rad R, Gygi S P, Haas W. Nat. Methods, 2011, 8(11): 937-940

16 ZHAO Yan, YING Wan -Tao, QIAN Xiao -Hong. Chem. Life, 2008, 28(2): 210-213

趙焱, 應(yīng)萬(wàn)濤, 錢小紅. 生命的化學(xué), 2008, 28(2): 210-213

17 Sherman J, McKay MJ, Ashman K, Molloy MP. Proteomics, 2009, 9(5): 1120-1123

18 Abbatiello SE, Mani DR, Keshishian H, Carr SA. Clin. Chem. , 2010, 56(2): 291-305

19 Kiyonami R, Schoen A, Prakash A, Peterman S, Zabrouskov V, Picotti P, Aebersold R, Huhmer A, Domon B. Mol. Cell. Proteomics, 2011, 10(2): M110. 002931

20 Cima I, Schiess R, Wild P, Kaelin M, Sch俟ffler P, Lange V, Picotti P, Ossola R, Templeton A, Schubert O, Fuchs T, Leippold T, Wyler S, Zehetner J, Jochum W, Buhmann J, Cerny T, Moch H, Gillessen S, Aebersold R, Krek W. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108(8): 3342-3347

21 Picotti P, Bodenmiller B, Mueller L N, Domon B, Aebersold R. Cell, 2009, 138(4): 795-806

22 Pichler P, Kocher T, Holzmann J, Mazanek M, Taus T, Ammerer G, Mechtler K. Anal. Chem. , 2010, 82(15):6549-6558

23 Thingholm T E, Palmisano G, Kjeldsen F, Larsen M R. J. Proteome Res. , 2010, 9(8): 4045-4052

24 McAlister G C, Nusinow D P, Jedrychowski M P, W俟hr M, Huttlin E L, Erickson B K, Rad R, Haas W, Gygi S P. Anal.Chem. , 2014, 86(14): 7150-7158

25 Wuhr M, Haas W, McAlister G C, Peshkin L, Rad R, Kirschner M W, Gygi S P. Anal. Chem. , 2012, 84(21):9214-9221

26 Wenger C D, Lee M V, Hebert A S, McAlister G C, Phanstiel D H, Westphall M S, Coon J J. Nat. Methods, 2011,8(11): 933-935

27 Goeringer D E, Asano K G, McLuckey S A. Anal. Chem. , 1994, 66(3): 313-318

28 Viner R, Bomgarden R, Blank M, Rogers J. 61st ASMS, 2013, Poster W617

29 Blank M, Bomgarden R, Rogers J, Jacobs R, Fong J, Puri N, Zabrouskov V, Viner R. 61st ASMS, 2013, Poster Th449

30 Weekes M P, Tomasec P, Huttlin E L, Fielding C A, Nusinow D, Stanton R J, Wang E C, Aicheler R, Murrell I,Wilkinson G W, Lehner P J, Gygi S P. Cell, 2014, 157(6): 1460-1472

31 Dephoure N, Gygi S P. Sci. Signal, 2012, 5(217): rs2

32 Werner T, Becher I, Sweetman G, Doce C, Savitski M M, Bantscheff M. Anal. Chem. , 2012, 84(16): 7188-7194

33 McAlister G C, Huttlin E L, Haas W, Ting L, Jedrychowski M P, Rogers J C, Kuhn K, Pike I, Grothe R A, Blethrow J D, Gygi S P. Anal. Chem. , 2012, 84(17): 7469-7478

34 Werner T, Sweetman G, Savitski MF, Mathieson T, Bantscheff M, Savitski M M. Anal. Chem. , 2014, 86(7): 3594-3601

35 Gallien S, Duriez E, Demeure K, Domon B. J. Proteomics, 2013, 9(81): 148-158

36 Karlsson C, Malmstrom L, Aebersold R, Malmstrom J. Nat. Commun. , 2012, 3: 1301

37 Gallart -Ayala H, Moyano E, Galceran M T. J. Chromatogr. A, 2008, 1208(1 -2): 182-188

38 Mart侏nez -Villalba A, Moyano E, Martins C P, Galceran M T. Anal. Bioanal. Chem. , 2010, 397(7): 2893-2901

39 Fortin T, Salvador A, Charrier J P, Lenz C, Bettsworth F, Lacoux X, Choquet -Kastylevsky G, Lemoine J. Anal. Chem. ,2009, 81(22): 9343-9352

40 Peterson A C, Russell J D, Bailey D J, Westphall M S, Coon J J. Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(11): 1475-1488

41 Schiffmann C, Hansen R, Baumann S, Kublik A, Nielsen P H, Adrian L, von Bergen M, Jehmlich N, Seifert J. Anal.Bioanal. Chem. , 2014, 406(1): 283-291

42 Gallien S, Duriez E, Demeure K, Domon B. J. Proteomics, 2013, 81: 148-158

43 Tsuchiya H, Tanaka K, Saeki Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2013, 436(2): 223-229

44 Tang H, Fang H, Yin E, Brasier A R, Sowers L C, Zhang K. Anal. Chem. , 2014, 86(11): 5526-5534

45 Gallien S, Bourmaud A, Kim S Y, Domon B. J. Proteomics, 2014, 100: 147-159

46 Gallien S, Duriez E, Crone C, Kellmann M, Moehring T, Domon B. Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(12): 1709-1723

47 Law K P, Lim Y P. Expert. Rev. Proteomics, 2013, 10(6): 551-566

48 Venable J D, Dong M Q, Wohlschlegel J, Dillin A, Yates J R. Nat. Methods, 2004, 1(1): 39-45

49 Gillet L C, Navarro P, Tate S, Rost H, Selevsek N, Reiter L, Bonner R, Aebersold R. Mol. Cell. Proteomics, 2012,11(6): O111. 016717

50 Liu Y, Huttenhain R, Surinova S, Gillet L C, Mouritsen J, Brunner R, Navarro P, Aebersold R. Proteomics, 2013,13(8): 1247-1256

51 Collins B C, Gillet L C, Rosenberger G, Rost H L, Vichalkovski A, Gstaiger M, Aebersold R. Nat. Methods, 2013, 10(12): 1246-1253

52 Lambert J P, Ivosev G, Couzens A L, Larsen B, Taipale M, Lin Z Y, Zhong Q, Lindquist S, Vidal M, Aebersold R,Pawson T, Bonner R, Tate S, Gingras A C. Nat. Methods, 2013, 10(12): 1239-1245

53 Chapman J D, Goodlett D R, Masselon C D. Mass Spectrom. Rev. , 2013: 10. 1002/ mas. 21400

54 Egertson J D, Kuehn A, Merrihew G E, Bateman N W, MacLean B X, Ting Y S, Canterbury J D, Marsh D M, Kellmann M, Zabrouskov V, Wu C C, MacCoss M J. Nat. Methods, 2013, 10(8): 744-746

55 Senko M W, Remes P M, Canterbury J D, Mathur R, Song Q, Eliuk S M, Mullen C, Earley L, Hardman M, Blethrow JD, Bui H, Specht A, Lange O, Denisov E, Makarov A, Horning S, Zabrouskov V. Anal. Chem. , 2013, 85(24):11710-11714

56 Kiyonami R, Patel B, Senko M, Zabrouskov V, Egertson J, Ting S, MacCoss M, Rogers J, Huhmer A. Large Scale Targe -ted Protein Quantification Using WiSIM -DIA Workflow on a Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer. ASMS, 2014, W737

57 ZHANG Wei, Reiko Kiyonami, JIANG Zheng, CHEN Wei. Chinese J. Anal. Chem. , 2014, 42(12): 1750-1758

張偉, Reiko Kiyonami, 江崢, 陳偉. 分析化學(xué), 2014, 42(12): 1750-1758

58 Prakash A, Peterman S, Ahmad S, Sarracino D, Frewen B, Vogelsang M, Byram G, Krastins B, Vadali G, Lopez M. J. Proteome Res. , 2014, doi: 10. 1021/ pr5003017

 

 

ZHANG Wei*

(Thermo Fisher Scientific, Shanghai 201206, China)

 

Abstract Mass spectrometry is an important and powerful tool for protein quantification. With the in -depth development of quantitative proteomics, limitations of classic MS based quantification methods, such as complicated matrix interference and throughput/ capacity limitation, start to appear. Recent progress of series novel MS based techniques provide effective solutions for the limitations of relative and absolute proteomic quantification, including synchronous precursor selection ( SPS), mass defect isobaric labeling, parallel reaction monitoring (PRM), multiplexing acquisition (MSX), and various novel data independent acquisition(DIA) modes. Here we summarized the current limitations of quantitative proteomics, reviewed the latest MS based quantification approaches, and discussed the features and advantages of these novel techniques for quantitative proteomic application.

 

Keywords Quantitative proteomics; Synchronous precursor selection; Parallel reaction monitoring; Data independent acquisition; Review

 

(Received 10 September 2014; accepted 18 October 2014)