三箱社交實(shí)驗(yàn)及自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)-雷帕霉素對(duì)自閉癥大鼠病癥行為的改善作用

雷帕霉素對(duì)自閉癥大鼠病癥行為的改善作用

摘要：

目的探討雷帕霉素(rapamycin)對(duì)自閉癥大鼠病癥行為的改善作用及相關(guān)機(jī)制。

方法采用丙戊酸鈉( sodium valproate VPA)一次性腹腔注射孕12.5 d大鼠制備自閉癥幼大鼠模型，雷帕霉素處理組于VPA注射后每天給大鼠口服4 mg/kg雷帕霉素直至斷奶。將出生幼鼠分為4組:對(duì)照組，VPA處理組，雷帕霉素處理組與VPA聯(lián)合雷帕霉素處理組。在幼鼠出生后35 d進(jìn)行社會(huì)交往行為檢測(cè)、神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)，并分離提取腦組織蛋白通過(guò)Western blot分析mTOR磷酸化水平及自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)情況;電鏡分析前額葉組織中自噬小體形成情況。結(jié)果成功制備自閉癥大鼠模型。與對(duì)照相比，VPA處理組社會(huì)交往能力下降、在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間增加、站立次數(shù)減少(P <0.05)，符合自閉癥行為特征;雷帕霉素單獨(dú)處理組無(wú)明顯行為學(xué)變化;但雷帕霉素聯(lián)合處理能明顯改善VPA處理導(dǎo)致的自閉癥行為癥狀(P <0.05) o  Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，VPA處理可增強(qiáng)大鼠前額葉、海馬及小腦組織中mTOR磷酸化水平，并降低LC3-II表達(dá)水平;而雷帕霉素聯(lián)合處理則能抑制上述腦組織中mTOR的磷酸化并增強(qiáng)LC3-II表達(dá)水平。電鏡分析結(jié)果表明，VPA處理可減少幼鼠前額葉組織中的自噬小體，而雷帕霉素聯(lián)合處理則能明顯增加自噬小體的形成。

結(jié)論雷帕霉素可改善自閉癥模型大鼠的病癥行為，機(jī)制可能與抑制mTOR活性并增強(qiáng)細(xì)胞自噬相關(guān)。

關(guān)鍵詞：雷帕霉素;自閉癥;自噬

自閉癥(autism)又稱兒童孤獨(dú)癥，是以嬰幼兒期就表現(xiàn)出交往障礙、語(yǔ)言障礙和(或)重復(fù)刻板行為為主要臨床特征的一種腦發(fā)育障礙綜合征，其發(fā)病率為2 / 1 000 } 6 / 1 000 }'}。目前我國(guó)約有60多萬(wàn)自閉癥兒童，男孩多于女孩，并且發(fā)病率還呈上升趨勢(shì)[}z}。自閉癥的發(fā)病原因復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、環(huán)境、飲食、教育等多個(gè)方面，至今尚未完全闡明[3]。

研究表明，Tscl基因敲除小鼠具有自閉癥類似癥狀，但詳細(xì)的分子機(jī)制尚不明確[#]。由于Tscl基因是Akt-mammalian target of rapamycin  ( mTOR)信號(hào)通路的重要中間分子[[5]，該基因缺失后會(huì)導(dǎo)致mTOR活性升高，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑的改變，尤其是細(xì)胞自噬被抑制。因此本課題組設(shè)想mTOR活性升高導(dǎo)致的細(xì)胞自噬水平下降可能是引起自閉癥發(fā)病的重要原因。為證明這一假說(shuō)，本研究以自閉癥大鼠為模型，觀察腦組織中細(xì)胞自噬水平變化情況，并探討mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)對(duì)自閉癥大鼠病癥行為的改善作用。

材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用Wistar大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。成年清潔級(jí)Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量300-350 g) 12只，雌性大鼠(體質(zhì)量200一250 g) 12只，飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥品及試劑

丙戊酸鈉( sodium valproate，VPA) , LC3抗體購(gòu)自Sigma公司，磷酸化mTOR抗體、GAPDH抗體購(gòu)自CellSignaling公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞裂解液購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio}ad公司，蛋白Marke:購(gòu)自北京中衫公司。

1.3動(dòng)物模型制備與分組

參照Sehneider等的方法，將雌、雄大鼠合籠過(guò)夜，次日早晨對(duì)雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1天(E1)，并將孕母鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。將孕鼠分為4組，分別為對(duì)照組、VPA處理組(即模型組)、雷帕霉素處理組及VPA聯(lián)合雷帕霉素處理組，每組3只。

VPA處理組與VPA聯(lián)合雷帕霉素處理組在E12. 5 d時(shí)給孕鼠腹腔注射VPA，劑量為600 mg/kg;同時(shí)給對(duì)照組與雷帕霉素處理組孕鼠腹腔注射等量的生理鹽水;雷帕霉素處理組及VPA聯(lián)合雷帕霉素處理組在E12. 5 d后每天給孕鼠口服雷帕霉素(4 mg/kg)直至仔鼠斷奶，其他小組口服等劑量溶劑(麻油)。VPA處理組孕鼠產(chǎn)下的仔鼠即為孤獨(dú)癥模型組，而對(duì)照組孕

鼠產(chǎn)下的仔鼠為正常對(duì)照組。幼鼠出生后第1天記為P1。各組幼鼠統(tǒng)一于出生后23 d (P23 )斷奶。

1.4社會(huì)交往行為檢測(cè)

在幼鼠出生后35 d，分別從每組各選擇6只進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)鼠均為雄性，出生時(shí)間相差不超過(guò)1d，體質(zhì)量差別小于15 g，分籠飼養(yǎng)。檢測(cè)在大小為60 cm x60 cm x 60 cm的透明三室箱內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前1d，所有被檢測(cè)鼠放入檢測(cè)室適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)將1只被測(cè)鼠放入中間小室先適應(yīng)10 min。然后在左側(cè)小室放置空鐵絲籠子，右側(cè)小室放入陌生幼鼠并用同樣的鐵絲籠子罩住。打開中間小室進(jìn)入左、右小室的通道，攝像記錄10 min內(nèi)被檢測(cè)鼠的行為，通過(guò)Supermaze軟件系統(tǒng)分別統(tǒng)計(jì)被檢測(cè)鼠自梳理(非社交行為)、嗅鐵絲籠子和陌生鼠(社交行為)時(shí)間。

1.5神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

同樣在幼鼠出生后35 d檢測(cè)，分別從模型組與對(duì)照組各選擇5只進(jìn)行檢測(cè)，被檢測(cè)大鼠的選擇標(biāo)準(zhǔn)同1.4。檢測(cè)在大小為25 cm x 25 cm x 38 cm的封閉箱內(nèi)進(jìn)行，箱子中央12 cm x 12 cm區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)。實(shí)驗(yàn)前1d，所有被檢測(cè)鼠放入檢測(cè)室適應(yīng)環(huán)境。檢測(cè)時(shí)將被檢測(cè)鼠放入檢測(cè)箱中央，攝像記錄5 min內(nèi)被檢測(cè)鼠的行為，通過(guò)Supermaze軟件系統(tǒng)分別統(tǒng)計(jì)被檢測(cè)鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間及直立次數(shù)。

1.6Western blot檢測(cè)

將出生后35 d的幼鼠斷頸處死，立即分離前額葉皮層、海馬和小腦組織。將各組織分別按100 mg/mL比例加入組織裂解液進(jìn)行勻漿。冰上靜置30 min后于4 0C 12 000 r/min離心30 min。取上清，測(cè)定蛋白濃度后置一80℃冰箱備用。將含50 ug總蛋白的組織樣品經(jīng)SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PEST洗滌后再加入二抗，室溫孵育1h。再經(jīng)PEST漂洗后加入化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。

1.7電鏡分析

將出生后35 d的幼鼠斷頸處死，立即分離前額葉皮層、海馬和小腦組織。將各組織分別進(jìn)行固定、塊染、脫水、浸透、包埋后切片，置于銅網(wǎng)上進(jìn)行透射電鏡觀察。全部樣品處理過(guò)程及觀察、拍照均在第三軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均用x士s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2. 1雷帕霉素處理顯著改善自閉癥大鼠的社會(huì)交往能力

社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，VPA處理組幼鼠社會(huì)交往能力顯著下降(P <0.05)，體現(xiàn)為自我梳理時(shí)間增加，不愿意與陌生幼鼠交往，不愿接觸新事物，符合自閉癥兒童的行為特點(diǎn)。雷帕霉素單獨(dú)處理組幼鼠與對(duì)照組相比社會(huì)交往能力無(wú)顯著差異;而雷帕霉素聯(lián)合處理則可以改善VPA處理導(dǎo)致的社會(huì)交往能力下降(P <0.05，圖1) 。

2. 2雷帕霉素處理明顯改善自閉癥大鼠的神經(jīng)病征行為

2. 2. 1雷帕霉素處理減少自閉癥幼鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間如圖2所示，對(duì)照組正常幼鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間較短，而VPA處理組幼鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間明顯增加，與對(duì)照組存在明顯差異(P <0.05)，符合自閉癥的行為特點(diǎn)。雷帕霉素單獨(dú)處理組幼鼠與對(duì)照組相比活動(dòng)方式無(wú)顯著差異;而雷帕霉素聯(lián)合處理則可以減少自閉癥幼鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間(P <0.05)，明顯改善自閉癥幼鼠的活動(dòng)方式。

2. 2. 2雷帕霉素處理增加自閉癥大鼠站立次數(shù)

如圖3所示，正常對(duì)照組幼鼠的站立次數(shù)顯著高于VPA處理組的自閉癥模型鼠(P <0.05)，而雷帕霉素聯(lián)合處理則可以明顯增加自閉癥幼鼠的站立次數(shù)(P<0. 05 )。

2. 3雷帕霉素處理增強(qiáng)自閉癥大鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織的自噬水平

分別分離各組幼鼠的前額葉皮層、海馬和小腦組織進(jìn)行Western blot分析。如圖4所示，與正常對(duì)照組相比，VPA處理組自閉癥幼鼠的前額葉皮層、海馬和小腦組織中的mTOR蛋白磷酸化明顯增強(qiáng)，而雷帕霉素可以特異性抑制mTOR蛋白磷酸化。對(duì)自噬標(biāo)志性蛋白LC3-II的水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，VPA處理組LC3-II水平明顯降低(P<0.05)，表明在自閉癥幼鼠的腦組織中自噬被抑制。使用雷帕霉素處理后，可以明顯增加自閉癥幼鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織中LC3-II的水平(P < 0. OS )，促進(jìn)自噬發(fā)生。對(duì)LC3-II的水平進(jìn)行定量分析也進(jìn)一步支持了這一結(jié)果。

為進(jìn)一步證實(shí)自噬在雷帕霉素改善自閉癥幼鼠病癥行為中的作用，對(duì)幼鼠前額葉組織中的自噬小體進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果見圖5。從圖5可看出，正常幼鼠前額葉組織中存在少量自噬小體(箭頭所示),VPA處理組則觀察不到自噬小體的存在，而雷帕霉素處理組及VPA聯(lián)合雷帕霉素處理均存在大量自噬小體。這一結(jié)果說(shuō)明雷帕霉素處理確實(shí)可以增加自閉癥幼鼠腦組織中的自噬水平。

3討論

在針對(duì)自閉癥的研究過(guò)程中，學(xué)者們建立了多種自閉癥動(dòng)物模型，如Tscl基因敲除鼠模型、病毒感染模型、VPA藥物處理模型等。在這些模型中，VPA一次性注射藥物模型是目前公認(rèn)的一種較理想的自閉癥動(dòng)物模型。該模型可以在行為上模擬自閉癥的刻板、重復(fù)等行為特征，且腦組織中的神經(jīng)形態(tài)變化也與自閉癥尸檢報(bào)告也相似。社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)是測(cè)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)

物社會(huì)交往能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中的陌生鼠與空籠子分別代表了新伙伴與新事物，通過(guò)分析規(guī)定時(shí)間內(nèi)被檢測(cè)鼠自我梳理、與陌生鼠及空籠子的接觸時(shí)間，從而判斷其社會(huì)交往能力。在本研究中，經(jīng)VPA處理的模型鼠社會(huì)交往能力明顯減弱，與自閉癥癥狀相符。

神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，在中央?yún)^(qū)所呆時(shí)間長(zhǎng)短反映了被測(cè)動(dòng)物的空間認(rèn)知能力，正常鼠對(duì)明亮、開放的新環(huán)境具有先天的躲避傾向，喜歡避開中央?yún)^(qū)、在四周角落中探尋，而對(duì)新環(huán)境認(rèn)知能力差的自閉癥鼠則停留在中央?yún)^(qū)的時(shí)間就會(huì)延長(zhǎng);站立次數(shù)反映了被測(cè)鼠在新環(huán)境中的探索能力，正常鼠站立次數(shù)多、探索能力強(qiáng)，而自閉癥鼠則站立次數(shù)減少、探索能力減弱。本研究中VPA處理的自閉癥模型鼠也具有相似的行為特征。VPA誘導(dǎo)大鼠發(fā)生自閉癥的藥理機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VPA可以增強(qiáng)大鼠前額葉、海馬與小腦組織中的mTOR磷酸化，從而增強(qiáng)mTOR活性，并抑制自噬的標(biāo)志性蛋白LC3-II的生成以及自噬小體的形成，這與TSC基因敲除自閉癥模型鼠中mTOR的活性增強(qiáng)具有相似性，表明這可能是VPA誘導(dǎo)自閉癥發(fā)生的重要機(jī)制。

雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酷類免疫抑制劑。研究表明，在帕金森、亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型中，雷帕霉素對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞均具有保護(hù)作用。在外傷性腦組織損傷動(dòng)物模型中雷帕霉素處理也可以減少神經(jīng)細(xì)胞的損害。但目前尚未見雷帕霉素處理改善自閉癥癥狀的相關(guān)報(bào)道。雷帕霉素在細(xì)胞內(nèi)的特異性分子靶點(diǎn)是mTOR，雷帕霉素可以特異性抑制mTOR的磷酸化并抑制其活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，雷帕霉素處理后大鼠前額葉皮質(zhì)、海馬及小腦組織中mTOR磷酸化水平明顯降低，mTOR活性明顯下降。由于mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝的關(guān)鍵分子，尤其與細(xì)胞自噬的發(fā)生密切相關(guān)，因此，雷帕霉素處理后神經(jīng)組織中自噬水平的增加可能是其改善自閉癥癥狀的重要機(jī)理。

自噬是細(xì)胞中降解長(zhǎng)壽命蛋白與細(xì)胞器并回收利用相關(guān)降解產(chǎn)物的重要分解代謝機(jī)制，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育與疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。自噬水平的降低是多種神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病等發(fā)病的重要原因。盡管自噬與自閉癥的發(fā)病關(guān)系目前尚少見報(bào)道，但在多種自閉癥模型動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了與自噬發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路的改變。如自閉癥模型動(dòng)物腦組織中Wnt信號(hào)通路的增強(qiáng),TSC基因敲除自閉癥模型鼠腦組織中mTOR信號(hào)通路的激活等，均可降低細(xì)胞中的自噬水平。由于mTOR通路是自噬發(fā)生的關(guān)鍵性上游通路，抑制該通路后可顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，因此本實(shí)驗(yàn)選用mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素來(lái)抑制該通路并進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞中的自噬水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)這一策略具有可行性，從而為自閉癥的治療提供了一定的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。