應(yīng)用Orbitrap Fusion對(duì)TMT標(biāo)記樣本進(jìn)行MS2定量方法以及SPS MS3定量方法的比較

 

顧培明 李 靜

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

 

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)由傳統(tǒng)的大規(guī)模鑒定逐步轉(zhuǎn)向了靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，研究?jī)?nèi)容已經(jīng)由蛋白質(zhì)鑒定擴(kuò)展到了蛋白質(zhì)相對(duì)和絕對(duì)定量，蛋白質(zhì)相對(duì)定量方法中應(yīng)用最普遍的為標(biāo)記定量，包括：ICAT，DIART，ICPL，TMT，iTRAQ 等等，其中又以TMT 以及iTRAQ 的應(yīng)用最為廣泛。

 

傳統(tǒng)的TMT 以及iTRAQ 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)均使用MS² 碎片報(bào)告離子來進(jìn)行定量，但是Steven P Gygi 等人發(fā)現(xiàn)該方法由于母離子篩選過程易受到基質(zhì)干擾，因而定量結(jié)果與真實(shí)值相比偏低，而使用MS3 碎片報(bào)告離子來進(jìn)行定量，則可以很好的解決這一問題，該方法的基本原理為：母離子碎裂產(chǎn)生的MS2 子離子用于定性，同時(shí)挑選碎片離子中強(qiáng)度最高的一個(gè)或者多個(gè)碎片離子，使用HCD 進(jìn)行進(jìn)一步的碎裂，產(chǎn)生的報(bào)告離子用于定量，雖然質(zhì)譜在選擇母離子時(shí)易受到基質(zhì)的干擾，但是選擇出來的母離子中絕大部分為目標(biāo)母離子，因而MS2 子離子中強(qiáng)度較高的碎片離子絕大部分來自于目標(biāo)母離子，挑選這些子離子的報(bào)告離子去做定量，定量結(jié)果會(huì)顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的應(yīng)用MS2 碎片報(bào)告離子的定量方法。

本文主要介紹了賽默飛世爾新一代三合一高分辨質(zhì)譜儀Orbitrap Fusion 應(yīng)用SPS MS3 定量方法以及MS2 定量方法對(duì)TMT 標(biāo)記樣本進(jìn)行定性與定量的實(shí)驗(yàn)，并對(duì)兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示：MS2 定量方法比SPS MS3定量方法可以鑒定并定量到更多的蛋白質(zhì)，而SPS MS3 定量方法與MS2 定量方法相比可以鑒定并定量到更多低豐度的蛋白質(zhì)，同時(shí)其定量結(jié)果也更加可靠。

 

 

小鼠DC 細(xì)胞系，分別進(jìn)行兩種不同的處理，連同對(duì)照組，抽提蛋白質(zhì)，酶解，分別使用TMT 標(biāo)記為127，130，131，其中對(duì)照組標(biāo)記為127，標(biāo)記完成后，三種標(biāo)記的樣本混勻，使用pH10，RP 梯度進(jìn)行分級(jí)，共得16 個(gè)餾分。

 

樣本使用A 液（0.1% FA，H2O）復(fù)溶，均上樣4.5ul，60 min 色譜梯度分離，使用Orbitrap Fusion 對(duì)樣本進(jìn)行定性以及定量分析，質(zhì)譜方法分別使用傳統(tǒng)的MS2 定量方法以及SPSMS³ 定量方法。

 

2.3.1 高效液相色譜條件

高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000

色譜柱：Easy-spray column(C18 ,3 μm, 100Å ,75 μm×15 cm)；

上樣量：均4.5 μL

流動(dòng)相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile

色譜梯度：

 

2.3.2 質(zhì)譜條件

2.3.2.1 MS2 定量方法

質(zhì)譜儀： Orbitrap Fusion

噴霧電壓：2.1 kV

毛細(xì)管溫度：275℃

S-lens：60%

碰撞能量：40% HCD

分辨率設(shè)置：一級(jí)120000@m/z 200，二級(jí)15000@m/z 200

母離子掃描范圍：m/z 350-1800；子離子掃描范圍：start

from m/z 100

Isolation Mode：Quadrupole

Data Dependent Mode：Top Speed

Cycle Time：3s

Exclusion Time：70s

2.3.2.2 SPS MS3 定量方法

質(zhì)譜儀： Orbitrap Fusion

噴霧電壓：2.1 kV

毛細(xì)管溫度：275℃

S-lens：60%

Data Dependent Mode：Top Speed

Cycle Time：3s

Exclusion Time：70s

MS1： Orbitrap

分辨率：120000@m/z 200

掃描范圍：m/z 400-1800

MS2: Ion Trap

Isolation Mode： Quadrupole

Activation Type： CID

Collision Energy：30%

MS3: Orbitrap

Precursor Exclusion：low：30，high:5

Number of Notches：10

Isolation Mode：Ion Trap

Activation Type：HCD

Collision Energy：65%

分辨率：30000@m/z 200

掃描范圍：m/z 100-400

 

原始文件（raw file）使用Proteome Discoverer 1.4 軟件搜索Uniprot_mouse.fasta 數(shù)據(jù)庫(kù)( 數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)10090)，檢索結(jié)果通過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選（1% FDR）。

 

3.1.1 鑒定結(jié)果匯總

 

 

Distribution of Protein Group Identified and QuantifiedUsing MS2 Quantitation Method among 16 Samples

 

Distribution of Peptide and Unique Peptide Identified Using MS2 Quantitation Method among 16 Samples

 

由上述表格以及柱狀圖可以看出，在16h 小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，一共鑒定到了3022 個(gè)蛋白質(zhì)，其中有2994 個(gè)蛋白質(zhì)有定量信息（即131/127,130/127 均有定量結(jié)果），顯示了Orbitrap Fusion 優(yōu)異的定性與定量能力。

 

原始文件（raw file）使用Proteome Discoverer 1.4 軟件搜索Uniprot_mouse.fasta 數(shù)據(jù)庫(kù)( 數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)10090)，檢索結(jié)果通過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選（1% FDR）。

 

3.2.1 鑒定結(jié)果匯總

 

 

 

Peptide and Unique Peptide Identified Using SPS MS3 Quantitation Method among 16 Samples

 

 

Distribution of Protein Group Identified and Quantified Using SPS MS3 Quantitation Method among 16 Samples

 

由上述表格及柱狀圖可以看出，在16h 小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，一共鑒定到了2788個(gè)蛋白質(zhì)，其中有2612 個(gè)蛋白質(zhì)有定量信息（即131/127,130/127 均有定量結(jié)果），顯示了Orbitrap Fusion 優(yōu)異的定性與定量能力。

 

 

Protein Group Identified by Two Methods

 

 

Protein Group Quantified by Two Methods

 

由上圖可以看出MS2 定量方法與SPS MS3 定量方法相比較，前者在定性與定量蛋白質(zhì)數(shù)目要高于后者，由于SPS MS3 定量方法需要將母離子在IT 中碎裂后，再挑選碎片離子去做SPS MS3，因而采集速度會(huì)慢于MS2 定量方法，導(dǎo)致定性與定量蛋白質(zhì)數(shù)目都略少。

 

此外，在樣本1-7 以及樣本8 中可以看出SPS MS3 定量方法可以鑒定并定量到更多的蛋白質(zhì)，雖然SPS MS3 定量方法的采集速度略慢于MS2 定量方法，但是由于其蛋白質(zhì)的定性是使用離子阱進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度要高于Orbitrap，而

定量報(bào)告離子是高能碎裂下的10 個(gè)碎片離子的報(bào)告離子強(qiáng)度總和，因而SPS MS3 定量方法與MS2 定量方法相比可以定性與定量到更多的低豐度蛋白質(zhì)。

 

 

 

由上圖可以看出，MS2 定量比值的log2 值絕大部分在-1與1 之間，而SPS MS3 定量比值的log2 值有部分小于-1或者大于1，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，MS2 由于受到基質(zhì)干擾的影響，蛋白質(zhì)定量比值與真實(shí)值相比會(huì)有所差異，定量差異偏小。

 

本次實(shí)驗(yàn)比較了最新高分辨質(zhì)譜儀Orbitrap Fusion 使用MS2 定量方法以及SPS MS3 定量方法在定性與定量蛋白質(zhì)數(shù)目以及定量結(jié)果之間的差異，在16h 的總檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，MS2 定量方法一共鑒定了3022 個(gè)蛋白質(zhì)，其中有2994 個(gè)蛋白質(zhì)有定量結(jié)果，SPS MS3 定量方法一共鑒定到了2788個(gè)蛋白質(zhì)，其中有2612 個(gè)蛋白質(zhì)有定量結(jié)果。從結(jié)果看，由于MS2 定量方法的掃描速度要略高于SPS MS3 定量模式的掃描速度，因而最終的結(jié)果顯示前者可以鑒定并定量到更多的蛋白質(zhì)，但是SPS MS3 定量方法可以鑒定并定量到更多低豐度的蛋白質(zhì)，此外，由于MS2 定量方法容易受到基質(zhì)干擾，定量差異偏小，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。