應(yīng)用LCQ 離子阱質(zhì)譜儀和Mass Frontier 軟件分析藥物中間體的痕量雜質(zhì)成分

由于將一個(gè)新藥帶入市場(chǎng)的成本非常高，藥物公司能夠開發(fā)的藥物數(shù)量就會(huì)受到限制。為此，在藥物研發(fā)的早期，大多使用復(fù)雜的篩選技術(shù)來(lái)剔除那些沒(méi)有潛力的候選藥物。若要成功，必須對(duì)代謝物和雜質(zhì)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性（簡(jiǎn)稱ADME/Tox）做出快速和準(zhǔn)確的評(píng)估來(lái)表征先導(dǎo)化合物。雜質(zhì)樣品的高通量分析對(duì)低濃度樣品，尤其是生物基質(zhì)中的低濃度樣品提出了挑戰(zhàn)。各種可能的修飾作用使數(shù)據(jù)解釋進(jìn)一步復(fù)雜化。Finnigan LCQ 系列離子阱質(zhì)譜儀具有高靈敏度、高選擇性和復(fù)雜數(shù)據(jù)相關(guān)等操作性能，能很好的適應(yīng)于藥物中雜質(zhì)分析的需求。在組合化學(xué)研究中能夠快速采集、解析和分析結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，對(duì)化合物篩選工作的順利進(jìn)行是至關(guān)重要的。Mass Frontier，是熱電用于解析和處理質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)的高級(jí)軟件包，配置該軟件包，能夠?qū)λ�提供分子結(jié)構(gòu)的碎裂途徑給出預(yù)測(cè)。在本文的研究中，使用了碎裂和機(jī)理模塊來(lái)確定一個(gè)先導(dǎo)藥物關(guān)鍵中間體的三個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

 

對(duì)一個(gè)先導(dǎo)藥物的關(guān)鍵中間體的雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)作結(jié)構(gòu)鑒定。

 

用于分析的藥物樣品由Eisai 研究所提供。所有實(shí)驗(yàn)在Finnigan LCQ 離子阱質(zhì)譜儀上采用APCI 模式完成。使用Finnigan SurveyorTM 液相色譜儀和AQUASIL C18 （250×2 mm）色譜柱完成液相色譜分離分析。液相色譜條件：40％水和60％乙腈的流動(dòng)相,等梯度洗脫，流速為300ul/ml，不分流（進(jìn)入質(zhì)譜）。

Finnigan LCQ 質(zhì)譜儀的離子源參數(shù)如下：

 

電離模式: 正離子，APCI

加熱毛細(xì)管溫度：175°C

蒸發(fā)溫度：325°

CAPCI 電流：5μA

鞘氣壓力：80 個(gè)單位

輔助氣壓力：20 個(gè)單位

 

Mass Frontier 軟件提供了專為提高質(zhì)譜圖解析速度而設(shè)計(jì)的高級(jí)分析工具包。作為八個(gè)模塊其中之一的碎裂和機(jī)理模塊，能夠根據(jù)用戶提供的化學(xué)結(jié)構(gòu)自動(dòng)預(yù)測(cè)碎片途徑和反應(yīng)機(jī)理�；�于模擬單分子離子離解反應(yīng)的算法，碎裂和機(jī)理模塊包含了針對(duì)電子轟擊電離、質(zhì)子化反應(yīng)和化學(xué)電離等已知的反應(yīng)機(jī)理。

 

碎裂和機(jī)理模塊的主要功能是：

● 核查所提供的化學(xué)結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)譜圖之間的相關(guān)性

● 確認(rèn)譜庫(kù)檢索給出的結(jié)果

● 識(shí)別在質(zhì)譜圖中最相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)差異

 

此外，碎裂和機(jī)理模塊可以模擬二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。當(dāng)用戶輸入指定化合物結(jié)構(gòu)，就會(huì)生成一系列理論碎片離子，與二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在本研究中，對(duì)假設(shè)化學(xué)結(jié)構(gòu)模擬產(chǎn)生的碎片離子與數(shù)據(jù)相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)觀察到的子離子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確認(rèn)了先導(dǎo)藥物關(guān)鍵中間體中三個(gè)痕量雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

 

對(duì)一個(gè)先導(dǎo)藥物關(guān)鍵中間體的最近流程評(píng)價(jià)，Eisai 研究所認(rèn)為在開始下一步工作前對(duì)這些中間體雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的深入分析是必要的。由于產(chǎn)權(quán)原因，圖1 僅給出了這個(gè)化合物的部分結(jié)構(gòu)。注射20μL（含100ng/μL 的藥物中間體和其雜質(zhì)）樣品到色譜系統(tǒng)，洗脫分離

 

 

圖 1. 關(guān)鍵藥物中間體的部分結(jié)構(gòu)圖

 

后進(jìn)入質(zhì)譜儀中檢測(cè)。LCQ 質(zhì)譜儀采用了數(shù)據(jù)相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜掃描模式，在這個(gè)模式下，一次運(yùn)行分析就可以采集到全掃描質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，而不需要預(yù)先指定二級(jí)質(zhì)譜的母離子質(zhì)量數(shù)。

 

圖2a 給出了分析的總離子流圖。藥物中間體在質(zhì)荷比m/z486處有很強(qiáng)的信號(hào)，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間是8.5 分鐘。另外觀察到背景離子（與樣品不相關(guān)）m/z 391，392 和393。從總離子流圖中扣除這些背景離子后，得到三個(gè)雜質(zhì)m/z 分別為 538, 488 和556 的色譜圖（見圖2b）。根據(jù)質(zhì)量數(shù)差異和同位素分布圖，推斷三個(gè)雜質(zhì)為在藥物中間體的雙鍵上分別添加了ClOH，H2，和 Cl2（在圖1 中以紅色標(biāo)記）。

 

 

圖 2.（a）保留時(shí)間在8.5分鐘的藥物中間體（m/z 486）的全掃描總離子流圖（b）扣除背景（m/z391, 392, and393）和藥物中間體（m/z486和487）后的低濃度雜質(zhì)（m/z538, 488 和556）離子流圖

 

圖 3 為三個(gè)雜質(zhì)的推斷結(jié)構(gòu)，圖 4 為三個(gè)雜質(zhì)測(cè)得的同位素分布和推斷結(jié)構(gòu)同位素分布的比較，圖5 為藥物中間體和三個(gè)雜質(zhì)的提取離子色譜圖。兩個(gè)含氯雜質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度是未修飾中間體的0.1％。由于儀器靈敏度和信噪比高，四個(gè)化合物可在一次數(shù)據(jù)相關(guān)的二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)被檢測(cè)到。動(dòng)態(tài)排除是數(shù)據(jù)相關(guān)采集的又一個(gè)特點(diǎn)，低含量成分即使在和高強(qiáng)度成分共同洗脫時(shí)，也能夠采集其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，這種功能適合低含量雜質(zhì)分析的要求。

 

 

如果沒(méi)有動(dòng)態(tài)排除功能，就采集不到二氫雜質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因?yàn)榕c二氫雜質(zhì)共同洗脫的未修飾中間體的強(qiáng)度更高。在二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)掃描中，排除列表中包括了m/z 391,392, 和393 的離子，以避免背景離子的二級(jí)質(zhì)譜分析。由于使用數(shù)據(jù)相關(guān)采集數(shù)據(jù)，就不需要在方法中輸入指定二級(jí)質(zhì)譜掃描的母離子質(zhì)量數(shù)。這樣就避免了先進(jìn)行全掃描實(shí)驗(yàn)，然后手動(dòng)查找二級(jí)質(zhì)譜掃描需要的母離子質(zhì)量數(shù)。對(duì)于低濃度成分分析，這個(gè)過(guò)程費(fèi)時(shí)且造成實(shí)驗(yàn)失誤。圖6 中，在與碎裂和機(jī)理模塊預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較前后，Mass Frontier 譜圖管理窗口可以顯示采集到的藥物中間體的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。特別是輸入藥物中間體化學(xué)結(jié)構(gòu)后，軟件就使用已知的單分子離解反應(yīng)模式來(lái)預(yù)測(cè)可能生成的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子。然后這些理論預(yù)測(cè)的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配分析。圖6 為程序給出的所有的主要二級(jí)質(zhì)譜碎片峰，證明了碎裂和機(jī)理算法對(duì)給定化學(xué)結(jié)構(gòu)二級(jí)質(zhì)譜預(yù)測(cè)的有效性。

 

 

圖7 為與預(yù)測(cè)的碎片離子相比較后的三個(gè)雜質(zhì)的實(shí)驗(yàn)二級(jí)質(zhì)譜圖。Mass Frontier 的預(yù)測(cè)是基于圖3 中三個(gè)雜質(zhì)推斷的結(jié)構(gòu)給出的。和圖6 一樣，如預(yù)測(cè)的碎片離子和實(shí)驗(yàn)二級(jí)質(zhì)譜中的離子匹配用紅色標(biāo)記。可以看到，實(shí)驗(yàn)得到的二級(jí)質(zhì)譜的所有主要離子都被紅色標(biāo)記，這有力支持了所推斷結(jié)構(gòu)的有效性。表1 匯總了Mass Frontier 軟件預(yù)測(cè)碎片結(jié)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)二級(jí)質(zhì)譜的相關(guān)性結(jié)果，來(lái)驗(yàn)證圖3 推斷的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。為了理解如何獲得到這樣的結(jié)果，必須意識(shí)到除了取代發(fā)生的位置（圖1 和圖3 紅色標(biāo)識(shí)），所提議的藥物中間體結(jié)構(gòu)和三個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)是相似的。因此，如果實(shí)驗(yàn)得到的四個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜中，每個(gè)化合物都有特定的碎片離子，而Mass Frontier 預(yù)測(cè)能給出相同的裂解機(jī)理，那么所提議的三個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)就是正確的：

 

● 如果Mass Frontier 軟件預(yù)測(cè)碎裂機(jī)理生成的碎片結(jié)構(gòu)不包含取代位，那么在實(shí)驗(yàn)得到的四個(gè)二級(jí)質(zhì)譜圖中應(yīng)有相同質(zhì)荷比的碎片離子。

● 如果Mass Frontier 軟件預(yù)測(cè)碎裂機(jī)理生成的碎片結(jié)構(gòu)包含了取代位（即如果實(shí)驗(yàn)得到的二級(jí)質(zhì)譜圖中藥物中間體的碎片離子的質(zhì)荷比為M，那么在二氫，氯羥基，二氯取代雜質(zhì)分別應(yīng)該有M+2, M+52 和M+70 質(zhì)荷比值），那么碎片離子的質(zhì)荷比應(yīng)存在取代基質(zhì)量數(shù)的差異。

 

在表1，Mass Frontier 軟件指定具有相同裂解機(jī)理的碎片離子被以相同顏色加重。這樣可以從表中看出，在所有情況下，由Mass Frontier 預(yù)測(cè)形成機(jī)理得到的有關(guān)聯(lián)的碎片離子要么有相同的實(shí)驗(yàn)質(zhì)荷比，要么有與取代基差異的實(shí)驗(yàn)質(zhì)荷比，這依賴于Mass Frontier 預(yù)測(cè)的碎片結(jié)構(gòu)是否有取代位。通過(guò)觀察證明了所推斷的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效性。

 

在數(shù)據(jù)相關(guān)二級(jí)質(zhì)譜模式和動(dòng)態(tài)排除的支持下，檢測(cè)和表征了含量在0.1％或以下的專利藥物中間體的三個(gè)雜質(zhì)。同位素分布和質(zhì)量差說(shuō)明了推斷結(jié)構(gòu)的合理性，并由Mass Frontier 所驗(yàn)證。通過(guò)Mass Frontier 預(yù)測(cè)碎片離子和實(shí)驗(yàn)得到的二級(jí)質(zhì)譜圖離子的比較，確定了所建議的三個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。該分析支持以下的結(jié)論：三個(gè)雜質(zhì)都來(lái)自于藥物中間體某雙鍵位置的化學(xué)取代。

 

● 所要分析的雜質(zhì)含量是母體成分豐度的0.1％以下，這是法規(guī)所要求的。Finnigan LCQ 離子阱質(zhì)譜儀具有高靈敏度和高選擇性，數(shù)據(jù)相關(guān)掃描模式，是成功完成雜質(zhì)分析的必備工具。

● Mass Frontier 譜圖管理和碎裂機(jī)理模塊技術(shù)能夠快速方便地完成結(jié)構(gòu)分析，并能對(duì)推斷的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)予以確認(rèn)。

 

藥物雜質(zhì)分析解決方案--離子阱多級(jí)液質(zhì)