SWATH技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題與解答

  SWATH（Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra）采集模式是蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院及AB SCIEX（全球領(lǐng)先的生命科學(xué)分析技術(shù)公司）的科學(xué)家聯(lián)合推出的一項(xiàng)基于質(zhì)譜應(yīng)用的新技術(shù)。利用此項(xiàng)技術(shù)，科學(xué)家有史以來(lái)首次可以獲得單獨(dú)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分析中每個(gè)肽段的數(shù)據(jù)。

Q: SWATH技術(shù)的原理是什么？

A: SWATH是MS/MSALL技術(shù)的擴(kuò)展，其采集模式是一種新型的MS/MS掃描技術(shù)，將掃描范圍劃分為以25Dalton為間隔的一系列區(qū)間，通過(guò)超高速掃描來(lái)獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。

Q: SWATH技術(shù)有哪些特點(diǎn)？

A：靈敏度高——SWATH技術(shù)繼承了MRM的數(shù)據(jù)采集模式，結(jié)合高分辨率的Triple-TOF 5600 plus質(zhì)譜系統(tǒng)，具有與MRM相當(dāng)?shù)撵`敏度；

可重現(xiàn)性高——重復(fù)樣品間的定量相關(guān)性可達(dá)到0.99以上；

定量準(zhǔn)確度高——定量準(zhǔn)確度幾乎與MRM技術(shù)相當(dāng)；

線性動(dòng)態(tài)范圍廣——定量范圍可跨越4個(gè)數(shù)量級(jí)；

Q: SWATH技術(shù)可以應(yīng)用于哪些方面？

A: SWATH技術(shù)可以用于蛋白質(zhì)組定量、蛋白復(fù)合體的鑒定和宿主蛋白（HCPs）分析。

蛋白質(zhì)組定量——對(duì)細(xì)胞、組織或器官中含有的不同時(shí)期、不同條件下蛋白表達(dá)水平的研究，生物標(biāo)志物的尋找都需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量。SWATH定量方法基于提取Transition峰面積計(jì)算出肽段含量，通過(guò)肽段含量推理出蛋白質(zhì)含量的方法。SWATH定量應(yīng)用到proteome-wide水平就產(chǎn)生了SWATH定量蛋白組，以此方法為基礎(chǔ)可以迅速鎖定幾個(gè)樣品間的差異蛋白質(zhì)。

蛋白復(fù)合體的鑒定——在所有細(xì)胞功能中，蛋白質(zhì)間的相互作用是最基本的活動(dòng)。采用TAP技術(shù)將目標(biāo)靶蛋白的相互作用蛋白特異性富集，然后結(jié)合具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高通量等特點(diǎn)的SWATH定量，能夠高特異性的準(zhǔn)確富集到靶蛋白的特異性相互作用蛋白，實(shí)現(xiàn)復(fù)合蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定。

宿主蛋白（HCPs）分析——質(zhì)譜能夠在快速有效分析HCPs的同時(shí)確保更好的準(zhǔn)確度，TripleTOF系統(tǒng)搭配SWATH采集模式分析HCPs，可以全面、準(zhǔn)確定量分析的同時(shí)獲得MSMS信息，一次進(jìn)樣即可完成任意數(shù)量HCPs的定量分析工作，并在30分鐘的LC梯度內(nèi)，完成ppm級(jí)HCPs的含量測(cè)定。

Q：iTRAQ、SILAC和SWATH相比呢？

A：iTRAQ定量蛋白質(zhì)組方法，該方法不依賴(lài)樣本，可以做任意樣本的總蛋白質(zhì)的差異定量，而且定量準(zhǔn)確。SILAC是僅僅適合細(xì)胞層次的蛋白質(zhì)組定量，組織的定量需要摸索或者前人已經(jīng)摸索的模式，中途測(cè)試新組織難度較大，細(xì)胞層次的SILAC培養(yǎng)費(fèi)用較高。SWATH是目標(biāo)蛋白質(zhì)組相關(guān)的定量模式， SWATH可以完成數(shù)千種蛋白的定量，準(zhǔn)確度極高，通量遠(yuǎn)高于MRM，對(duì)于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞分泌物等樣本，SWATH效果非常好。SWATH本身對(duì)物種沒(méi)有偏向性，也是目標(biāo)蛋白定量的一種，定量結(jié)果準(zhǔn)確，可以和MRM媲美，發(fā)文章更具有說(shuō)服力。

Q：采用SWATH技術(shù)對(duì)樣品有什么要求？

A：采用SWATH技術(shù)，要求樣本物種具有基因組序列、ESTs序列或蛋白質(zhì)參考序列，適合用于檢測(cè)細(xì)菌等復(fù)雜度較低的樣本，一般樣本蛋白含量至少10ug。

Q：關(guān)于“樣品重復(fù)”，技術(shù)重復(fù)和上機(jī)重復(fù)有什么區(qū)別？發(fā)表的文章一般要求幾次重復(fù)呢？

A： 一般的文章會(huì)要求做2~3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，僅作1次實(shí)驗(yàn)是有風(fēng)險(xiǎn)的，因?yàn)槿绻�是�?shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題，缺乏結(jié)果的評(píng)估，往往說(shuō)服力不夠，對(duì)文章發(fā)表可能構(gòu)成影響。

技術(shù)重復(fù)主要目的是為了驗(yàn)證試驗(yàn)流程的穩(wěn)定性，當(dāng)三次上級(jí)重復(fù)的結(jié)果一致或者相似時(shí)，我們可以判定對(duì)樣本的處理過(guò)程是穩(wěn)定的。上機(jī)重復(fù)的主要目的是驗(yàn)證儀器的穩(wěn)定性，當(dāng)三次上機(jī)結(jié)果接近或者一致，我們即可判定質(zhì)譜儀性能是穩(wěn)定的。當(dāng)前的上機(jī)重復(fù)仍然在一些JPR和MCP文章中可見(jiàn)，即沿用了早期的習(xí)慣。而應(yīng)用型的文章中，上機(jī)重復(fù)或技術(shù)重復(fù)一般沒(méi)有硬性規(guī)定，可以不做，如果做了當(dāng)然最好，Editor就不會(huì)再此處找你的問(wèn)題。

Q：進(jìn)行SWATHTM數(shù)據(jù)處理時(shí)，建立離子數(shù)據(jù)庫(kù)的最佳方法是什么？

A：現(xiàn)在用于SWATH靶向數(shù)據(jù)處理的工作流程非常簡(jiǎn)單，只需要多肽母離子m/z，主要碎片的m/z和相對(duì)豐度，以及保留時(shí)間。目前建立離子數(shù)據(jù)庫(kù)主要使用兩種策略：DDA采集數(shù)據(jù)蛋白鑒定或來(lái)源于外部數(shù)據(jù)庫(kù)。在第一種方法中，通過(guò)信息依賴(lài)采集方法(DDA)對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，蛋白通過(guò)ProteinPilotTM軟件或其它的搜素引擎進(jìn)行鑒定，鑒定到的多肽即為用于SWATH數(shù)據(jù)處理的離子數(shù)據(jù)庫(kù)。選擇1D LCMS 或者2D LCMS技術(shù)路線取決于我們研究對(duì)象數(shù)據(jù)庫(kù)的復(fù)雜度。借助生物信息學(xué)方法，還可以對(duì)來(lái)自于外部數(shù)據(jù)庫(kù)的MSMS數(shù)據(jù)進(jìn)行靶向蛋白分析，同時(shí)創(chuàng)建離子數(shù)據(jù)庫(kù)，此時(shí)需要進(jìn)行保留時(shí)間校正。

Q：通過(guò)SWATHTM方法采集數(shù)據(jù)時(shí)，進(jìn)行保留時(shí)間校正的最佳策略是什么？

A：通過(guò)SWATHTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，需要確定一個(gè)合理的窄的保留時(shí)間窗口，以避免選擇錯(cuò)誤的色譜峰�，F(xiàn)在有兩種策略用于校正實(shí)際觀察到的保留時(shí)間和數(shù)據(jù)庫(kù)中的保留時(shí)間的差異。通過(guò)在樣品中增加多肽標(biāo)準(zhǔn)品，用于數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建和SWATH數(shù)據(jù)采集，或者使用樣品中存在的某些已知的中等/高豐度的多肽作為參考物對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行校正。