應(yīng)用氣相-靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用對制藥包裝容器材料中可浸出雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證分析
應(yīng)用氣相色譜-靜電場軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜聯(lián)用對制藥包裝容器材料中的可浸出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證分析
關(guān)鍵詞
可萃取物和可浸出物、Q Exactive GC、靜電場軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜儀、差異分析、未知物鑒定、容器密閉系統(tǒng)、制藥。
前言
塑料、聚合物及其它制藥產(chǎn)品專用包裝材料可析出具有潛在毒性的化學(xué)雜質(zhì)，針對此類物質(zhì)的檢測研究不僅是制藥行業(yè)的關(guān)注熱點(diǎn)，同時(shí)也是對相關(guān)分析人員的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。通常來說，可萃取物和可浸出物（E/L）研究的主要目的在于對任何可能由包裝材料遷移至最終產(chǎn)品、藥物中的污染物進(jìn)行定性確認(rèn)、定量檢測，并盡可能降低其含量。“可萃取物”是指容器密閉系統(tǒng)中可在實(shí)驗(yàn)室加速條件下進(jìn)入溶劑中從而被提取出的化學(xué)物質(zhì)。其中，實(shí)驗(yàn)室加速條件包括升溫和強(qiáng)烈溶劑，而加速目的是在避免材料降解、異變的前提下實(shí)現(xiàn)最大提取量�！翱山鑫铩眲t被定義為在產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)可由包裝遷移至藥物產(chǎn)品中的化學(xué)物質(zhì)。
對于產(chǎn)品使用者所產(chǎn)生的潛在與實(shí)際影響概括如下：
• 可萃取物 = 可能產(chǎn)生影響
• 可浸出物 = 實(shí)際產(chǎn)生影響
兩類雜質(zhì)的檢測樣本主體：
• 可萃取物 = 容器材料
• 可浸出物 = 最終產(chǎn)品
可萃取物研究主要通過快速鑒定潛在的毒性可浸出物和選擇不同的包裝材料來降低使用風(fēng)險(xiǎn)。通常對于絕大多數(shù)藥物劑型來 說，任何與藥物有效成分（API）存在直接接觸的材料都應(yīng)進(jìn)行可萃取物和可浸出物分析；在某些情況下，藥物二級包裝或三級包裝（比如標(biāo)簽）同樣需要進(jìn)行相關(guān)分析。藥物容器密閉系統(tǒng)及生產(chǎn)全過程均可引入可浸出物。此外，藥物還可與包裝材料發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生可浸出物雜質(zhì)，此反應(yīng)可在藥品儲存過程中持 續(xù)發(fā)生。1 實(shí)驗(yàn)人員通過將包裝材料暴露于極端溶劑、pH 以及溫度條件下，以觀察產(chǎn)品在惡劣環(huán)境中的變化，從而完成可萃取物對比實(shí)驗(yàn)。目前，要對所有化合物進(jìn)行檢測、鑒定是一項(xiàng)相當(dāng)艱巨的任務(wù)，分析人員需要應(yīng)用各種分析技術(shù)來保證物質(zhì)確證的準(zhǔn)確性和全面性。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）廣泛應(yīng)用于可萃取物研究，其應(yīng)用優(yōu)勢主要體現(xiàn)于良好的色譜分辨率、重現(xiàn)性、峰容量以及最重要的一點(diǎn)：可用于鑒定匹配的豐富商業(yè)譜圖庫。同時(shí)，包裝產(chǎn)品中含有大量揮發(fā)性、半揮發(fā)性組分也是該技術(shù)適用于此類分析的主要原因。本次測試應(yīng)用具備超高分辨率和質(zhì)量精度 質(zhì)譜系統(tǒng)的新一代 GC-MS 系統(tǒng)，對包裝密閉系統(tǒng)和密封產(chǎn)品所使用的聚合物墊圈（環(huán)型密封圈）中的化合物進(jìn)行檢測和鑒定。本實(shí)驗(yàn)旨在展示針對環(huán)型密封圈中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析的完整工作流程。本流程重點(diǎn)在于通過一級高分辨質(zhì)譜全掃描對樣品進(jìn)行無目標(biāo)監(jiān)測，借助超高分辨率的優(yōu)勢獲得化合物的精確質(zhì)量數(shù)。質(zhì)譜分辨能力對于準(zhǔn)確推測化合物元素組成、分析結(jié)構(gòu)、區(qū)別共流出物和同量異位素化合物具有重要作用�？焖俚膾呙杷俣取⒏哽`敏度和寬線性范圍則利于對高低豐度化合物進(jìn)行同時(shí)檢測。這些儀器特性結(jié)合可進(jìn)行自動(dòng)解卷積算法和樣本比較的獨(dú)特軟件系統(tǒng)，組成了一個(gè)針對復(fù)雜化合物結(jié)構(gòu)分析的有力解決平臺。
實(shí)驗(yàn)條件
樣品與前處理
本次可浸出雜質(zhì)研究共檢測了四種環(huán)型密封圈樣本；A – 紅色 密封圈，B – 棕色密封圈，C – 白色密封圈，D – 黑色密封圈。實(shí)驗(yàn)人員按照 BioPhorum Operation Group（BPOG）規(guī)范要 求進(jìn)行加速溶出實(shí)驗(yàn)。樣本剪成 20 mm 小段，并分別浸入含 10 mL 100% 乙醇、50% 乙醇、注射用水（WFI）以及 5M 氯 化鈉（NaCl）的密封螺紋蓋小瓶中，在 40℃ 條件下放置 30 天。使用相同的方法處理用于色譜比較的相應(yīng)空白溶劑樣本。 各樣本提取物分別取等份體積置于 GC 樣品瓶中用于分析。 在進(jìn)入GC 分析前，所有液體樣本需經(jīng)二氯甲烷進(jìn)行液液萃取處理。
儀器參數(shù)和方法設(shè)置
所有實(shí)驗(yàn)采用 Thermo Scientific™ Q Exactive™ GC Orbitrap™ GC-MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行測試。進(jìn)樣步驟采用 Thermo Scientific™ TriPlus™ RSH 自動(dòng)進(jìn)樣器，并通過 Thermo Scientific™ TRACE™ 1310 氣相色譜儀和 配備 10 m 預(yù)柱的 Thermo Scientific™ TraceGOLD™ TG-5SilMS 色譜柱（30 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 µm, P/N 26096-1425）實(shí)現(xiàn)色譜分離。其它儀器參數(shù)見下表。
Q Exactive GC系統(tǒng)采用 EI 一級全掃描模式，質(zhì)量分辨率設(shè)定 為 60,000（FWHM， m/z 200）。此外，還采用甲烷作為反應(yīng) 氣體進(jìn)行正化學(xué)電離（PCI）分析，以獲取鑒定未知組分所需
要的分子離子信息。
數(shù)據(jù)處理
應(yīng)用 Thermo Scientific™ TraceFinder™ 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。該軟件包為單平臺控制，可實(shí)現(xiàn)儀器控制，儀器方法建立、優(yōu)化，并以定性、定量分析為導(dǎo)向進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的整體工作流 程。TraceFinder 軟件還同時(shí)具備對高分辨質(zhì)譜圖進(jìn)行解卷積和譜圖比對的功能。
結(jié)果與討論
本次測試的主要目的是采用無目標(biāo)、一級質(zhì)譜全掃描數(shù)據(jù)采集模式分析環(huán)型密封圈中的溶劑可浸出物。通過與對照樣本（空白乙醇）進(jìn)行兩兩比較，從而找出環(huán)型密封圈提取物中特有的色譜峰并進(jìn)行鑒定分析。此外，實(shí)驗(yàn)人員期望能夠利用樣本化合物的精確質(zhì)量數(shù)和譜圖匹配信息對化合物實(shí)現(xiàn)快速鑒定。為了完成上述目標(biāo)，我們設(shè)計(jì)并實(shí)施了一個(gè)完整的工作流程。本 工作流程細(xì)節(jié)概括詳見圖 1。
分離獨(dú)特化學(xué)組分
對所有樣本進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描分析，總離子流色譜圖（TICs） 見圖 2。Q Exactive GC 系統(tǒng)可在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)完成精確質(zhì)荷比檢測，這樣無論化合物濃度高低，均可在不犧牲質(zhì)量精度的前提下被無差別檢測到。這項(xiàng)能力可有力提高鑒定復(fù)雜樣品中未知化合物的確信度。數(shù)據(jù)分析的第一步是通過與空白樣本比較，找出各樣本中獨(dú)特的或者含量有顯著提高的色譜峰。雖然 可由 TICs 中看到各個(gè)色譜峰，但為了全面表征測試樣品中的化合物、不遺漏任何潛在的毒性化合物，我們?nèi)杂斜匾獙?shù)據(jù)中的所有色譜峰進(jìn)行提取分析。
應(yīng)用 TraceFinder 軟件進(jìn)行測試樣本和空白樣本間的兩兩比較完成數(shù)據(jù)表征。軟件首先進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)解卷積分析，找出 所有信噪比高于 30:1 的離子峰，并盡可能清除相同保留時(shí)間的質(zhì)譜圖中的雜峰，使化合物離子峰最大化以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹 配。圖 3 以辛酸乙酯為例，展示其解卷積峰以及整個(gè)色譜峰中的掃描點(diǎn)、各基峰的精確質(zhì)量偏差（ m/z 129.0910）。將提取出的峰列表與空白樣本比較，分類出測試樣品中特有的峰組 分。TraceFinder 軟件還可通過熱圖的形式快速發(fā)現(xiàn)測試樣品 中含量升高的組分（圖 4）。例如，保留時(shí)間為 17.49 min 、 基峰為 m/z 277.07800 的色譜峰在棕色環(huán)型密封圈中含量顯著升高。
通過譜庫匹配鑒定化合物
找出特異性的色譜峰之后，我們需要對該化合物進(jìn)行鑒定。 應(yīng)用 TraceFinder 軟件可自動(dòng)完成鑒定步驟（圖 5）。首先，將化合物的解卷積質(zhì)譜圖在現(xiàn)有的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫（例 如，NIST 2014）中進(jìn)行檢索匹配，所有檢索結(jié)果將結(jié)合檢索 正相關(guān)（SI）得分和高分辨過濾（HRF）值進(jìn)行綜合評分排 序。其中，HRF 值代表了質(zhì)譜圖中碎片峰的精確質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中相應(yīng)碎片元素組成相符的百分比。
結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)匹配結(jié)果以及對譜圖中碎片離子元素組成的解 釋分析可實(shí)現(xiàn)對未知化合物的快速結(jié)構(gòu)確證。對于保留時(shí)間為 17.49 min 的離子流峰來說，譜庫匹配度最高的結(jié)果為三苯基 氧化膦，譜圖中離子精確質(zhì)量數(shù)的相符比例達(dá) 98.8%。碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖中相應(yīng)碎片的元素組成質(zhì)量偏差小 于 1 ppm，這樣極大地提高了鑒定結(jié)果確信度。樣品譜圖中的 基峰 m/z 277.07790 對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)譜圖中的 [M-H]+ 離子，由其元 素組成 C18H14OP 計(jì)算該離子的精確質(zhì)量數(shù)為 m/z 277.07768， 與實(shí)測譜圖偏差為 0.8 ppm。如果僅通過傳統(tǒng)的檢索索引來對檢索結(jié)果進(jìn)行分類排序，可檢索出許多均有同樣良好匹配度的 化合物結(jié)果（>700）。而由于離子精確質(zhì)量數(shù)與實(shí)測譜圖不符，這些結(jié)果在本次分析中被自動(dòng)過濾。
此外，我們還可通過評價(jià)相應(yīng)的 PCI 譜圖，進(jìn)一步確證三苯基氧 化膦的結(jié)構(gòu)鑒定準(zhǔn)確性（圖 6）。在 PCI 數(shù)據(jù)中可尋找常見的加 合離子如 [M+H]+ 或 [M+C2H5]+ 來推測母離子的元素組成，從而評 價(jià)相應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)偏差是否在理想偏差之內(nèi)（<1 ppm）。 在三苯基氧化膦的 PCI 譜圖中，我們分別找到了具備超高質(zhì)量準(zhǔn) 確度的相關(guān)加合離子 [M+H]+ （質(zhì)量偏差 0 ppm）、[M+C2H5]+ （0.2 ppm）和 [M+C3H5]+ （0.4 ppm）。
鑒定無譜庫匹配結(jié)果的化合物結(jié)構(gòu)
在 EI 譜圖無法在標(biāo)準(zhǔn)譜庫中檢索出確定結(jié)果的情況下，我們 可以通過 PCI 譜圖中的精確質(zhì)量數(shù)信息推測母離子的元素組成。良好的質(zhì)量精度可有效減少元素組成推測結(jié)果數(shù)量，這對于提高化合物的結(jié)構(gòu)鑒定準(zhǔn)確性尤為必要。在黑色環(huán)型密封圈 樣品中有一個(gè)保留時(shí)間為 15.17 min 的離子流峰并未在 NIST譜庫中檢索到理想的匹配結(jié)果。所有的相關(guān)檢索結(jié)果均因精 確質(zhì)量數(shù)數(shù)據(jù)不符而被排除。通過 PCI 數(shù)據(jù)中的加合離子信 息推測準(zhǔn)分子離子（圖 7）。該圖譜顯示離子 m/z 325.14344 為 [M+H]+（0 ppm）， m/z 353.17483 為 [M+C2H5]+（0.3 ppm）。以上離子表明 EI 譜圖中的 m/z 324.13541 應(yīng)為分子離子峰。通過分子離子可推測出母離子的元素組成。這一步分析是化合物結(jié)構(gòu)鑒定的關(guān)鍵步驟。此時(shí)，良好的質(zhì)量精度可減 少可能的元素組成數(shù)量。例如，若設(shè)置質(zhì)量精度容許窗口為 10 ppm，在碳原子（1-30）、氫原子（1-60）、氮原子（1-5）、 氧原子（1-5）、磷原子（1-5）及硫原子（1-2）的范圍內(nèi)有 16 種可能的元素組成。相較之下，若將質(zhì)量精度容許窗口設(shè)為 1 ppm，則只有一個(gè)可能的元素組成：C20H20O4。只有將質(zhì)量精 度控制在較小的范圍內(nèi)，才能夠有效減少需要進(jìn)一步檢查的元素組成數(shù)量，提高分析結(jié)果可信度。上述元素組成推測結(jié)果在 PCI 譜圖中的 [M+H]+ 和 [M+C2H5]+ 加合離子的精確質(zhì)量數(shù)信 息得到印證。除了這個(gè)保留時(shí)間為 15.17 min 的離子流峰外， 在保留時(shí)間為 15.29 min 的離子流峰有著特征相似的 EI 和 PCI 譜圖，推測為相同化合物的同分異構(gòu)體。
原文的元素組成設(shè)定范圍寫錯(cuò)了，應(yīng)為“碳原子（1-30）、 氫原子（1-60）、氮原子（0-5）、氧原子（0-5）、磷原子 （0-5）及硫原子（0-2）”。
圖 7. 黑色環(huán)型密封圈樣品（D）中保留時(shí)間為 15.17 min 的未 知化合物的 EI 和 PCI 圖譜。由 PCI 圖譜中的準(zhǔn)分子離子峰及 相關(guān)加合離子推測其元素組成為C20H20O4。
確證化合物元素組成和結(jié)構(gòu)信息的最后一步需要參考碎片離子 的精確質(zhì)量數(shù)。為了完成這一步驟，我們可以直接分析 EI 譜 圖中的碎片離子或者單獨(dú)采集相應(yīng)的 MS/MS 數(shù)據(jù)以確認(rèn)碎片 離子來源于該母離子。通過四級桿分離出離子 m/z 325.14， 將其引入 HCD 碰撞池內(nèi)分解碎裂。圖 8 為 m/z 325.14 的 MS/ MS 圖譜。所有碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)在推測母離子元素容許 范圍內(nèi)偏差均小于 1 ppm。這樣，即使我們沒有辦法對該化合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，仍然可以提取到有關(guān)該化合物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確細(xì)節(jié)信息。
所有四種環(huán)型密封圈樣本均經(jīng)由相同的解析流程進(jìn)行分析。結(jié) 果總結(jié)見表 1。我們分析了每個(gè)樣本中含量最高的組分。鑒定 結(jié)果均基于標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹配以及 EI 和 PCI 譜圖中分子離子或加合離子的精確質(zhì)量數(shù)推測得出。黑色和棕色的環(huán)型密封圈的乙 醇提取物中化合物含量最高，白色環(huán)型密封圈則含量最低。從 TIC 中可明顯看出，紅色環(huán)型密封圈樣品被環(huán)硅氧烷類化合物污染。污染物未列于最終結(jié)果列表中。
結(jié)論
本次測試結(jié)果表明 Q Exactive GC 組合型四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀與 TraceFinder 軟件聯(lián)合應(yīng)用，可對快速表征復(fù)雜樣品并完成未知組分結(jié)構(gòu)鑒定。靜電場軌道阱質(zhì)譜可提供一個(gè)樣品中所有組分的偏差極小的質(zhì)量信息，因此無論組分含量高低，我們均可參考相關(guān)信息對其進(jìn)行快速、可信的定性分析。
• 穩(wěn)定、耐用的色譜分離配合快速的數(shù)據(jù)掃描速度使得Q Exactive GC 系統(tǒng)成為表征復(fù)雜樣品化學(xué)組成的理想平臺。
• 亞 ppm 級質(zhì)量偏差以及出色的靈敏度使可靠鑒定樣品中所有 化學(xué)組分成為可能。常規(guī)測試采用的質(zhì)量分辨率為 60,000 FWHM，結(jié)合寬動(dòng)態(tài)范圍特點(diǎn)，可有效消除同質(zhì)異位素干擾，提高復(fù)雜基質(zhì)中化合物鑒定的可信度。
• TraceFinder 軟件對環(huán)型密封圈樣品進(jìn)行可快速、深入的表征，并對單個(gè)組分實(shí)現(xiàn)分離以及可靠鑒定。
• EI 和 PCI 數(shù)據(jù)相結(jié)合并與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫比較從而推測化合物結(jié)構(gòu)。若標(biāo)準(zhǔn)譜庫中沒有匹配結(jié)果，可通過具備超高質(zhì)量精度的精確質(zhì)量數(shù)信息可信地推測化合物的元素組成。在精確質(zhì)量數(shù)的基礎(chǔ)上，推測鑒定結(jié)果可迅速被確認(rèn)或排除。
參考文獻(xiàn)
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