徠卡課堂 | 科研中的尖兵利器淺析——共聚焦篇

在科研的戰(zhàn)場上，你是否還在苦于尋找更出色的成像技術與手段？你是否還在糾結觀察到的實驗現(xiàn)象能否真實的反映樣品的情況？你是否還在為圖像質量差而不能發(fā)表高質量的論文而苦惱？“工欲善其事必先利其器”，共聚焦將為你更好的解決這些問題。

與傳統(tǒng)的寬場成像相比，共聚焦作為一種高端的顯微成像術，以其出色的成像質量及三維重構能力，儼然已成為一種主流的成像方式。接下來小編將帶你進入共聚焦的世界，為你淺析共聚焦的基本原理及其在生物研究領域的應用。

共聚焦原理

激光共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）利用放置在光源（激光）后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔（pinhole）實現(xiàn)點照明和點探測，光源通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔內(nèi)，焦平面以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。因此，通過共聚焦能夠清晰地獲得焦平面上的熒光信號。

圖1 左右兩邊分別是普通寬場顯微鏡和共聚焦顯微鏡的成像光路，共聚焦顯微鏡利用點探測和點照明技術獲得高清晰度的圖像。

計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。隨著載物臺沿Z軸上下移動，樣品的新層面又成像在顯示器上，這樣就可得到樣品不同層面的連續(xù)光切圖像(Z-stack)，進一步通過三維重構就能獲得樣品精確的三維信息。

圖2 左：共聚焦顯微鏡的點掃描及Z軸層切模式；右：通過共聚焦顯微術對視網(wǎng)膜神經(jīng)元進行三維重構。

共聚焦應用

相對于普通寬場成像，共聚焦能獲得高分辨率高清晰度的三維圖像，因此其應用范圍更廣，接下來小編將介紹共聚焦顯微鏡在生物研究領域的幾點重要應用。

熒光定位及三維重建

激光共聚焦顯微鏡最重要的應用莫過于熒光定位的觀察與三維重構。通過熒光定位觀察可以得知感興趣的蛋白在細胞或組織中的定位情況，而結合對細胞器或細胞骨架等結構進行標記可以得到該蛋白的亞細胞定位，通過與其他蛋白進行雙色或多色共染可以分析兩個或多個蛋白的共定位情況。

圖3 左: 通過共聚焦顯微鏡對細胞微絲骨架（綠色，phalloidin）及線粒體（紅色，mitrotracker）結構的清晰成像；右：通過共聚焦顯微鏡對果蠅卵結構的三維重構。

共聚焦通過點掃描對樣品進行成像，通過不斷移動Z軸實現(xiàn)對樣品的三維層切并通過三維重構獲得樣品精確的三維信息（被稱為“細胞 CT”），進而可以更準確地在Z軸上分析蛋白的定位情況。

熒光定量及共定位分析

如果你要對樣品的熒光信號進行定量，那么通過徠卡共聚焦顯微鏡操作軟件可以輕松達到這一目的，操作簡便快捷。

圖4 通過共聚焦軟件對熒光信號進行定量：選中quantify-intensity-stack profile選項，通過ROI工具框選待分析區(qū)域，在窗口中間即顯示所選區(qū)域的所有信息，包括熒光通道、平均熒光

如果你要對兩個或多個信號進行共定位分析，我們的軟件也應對自如。

圖5 通過共聚焦軟件對熒光信號共定位情況進行分析：選中quantify-colocalization選項，通過ROI工具框選待分析區(qū)域，在窗口中間即顯示所選兩個通道的共定位參數(shù)，包括Pearson系數(shù)、共定位比率等。

多點掃描及拼圖

假如你的樣品需要拍攝大視野而同時又需要高分辨率怎么辦呢?不用著急，我們的軟件里有自動拼圖功能，你只需要設置好所拍攝視野對角線上的兩個端點，軟件便會自動進行運算并進行自動拼圖拍攝。同樣的，如果你不需要拼圖，僅需要拍攝多點，我們的軟件也可以輕松幫你實現(xiàn)。

圖6 自動拼圖（左）和多點成像（右）模式。

圖7 對小鼠鼻腔層斷面的大視野高清晰度拼圖。左：48個視野的自動拼圖（40倍物鏡），右：對左圖中框選區(qū)域的放大。

活體成像

共聚焦不僅能對固定樣品進行成像，對活細胞或組織樣品進行成像也是小菜一碟，只要你設置好相關參數(shù)就可以輕松拍攝了。當然，活體拍攝過程中維持樣品活性的條件是要保證的，如細胞培養(yǎng)的溫度、濕度及二氧化碳濃度等，這都可以通過選擇共聚焦顯微鏡相關配件輕松實現(xiàn)。這樣你就可以通過活體拍攝追蹤細胞增殖、細胞運動、細胞骨架動態(tài)變化、細胞內(nèi)鈣離子信號變化等生命過程了。

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視頻1 對COS7細胞中微管結構進行共聚焦活體成像，共拍攝5分鐘，時間間隔5秒。
（Courtesy: Dr. Yasushi Okada, University of Tokyo）

高級應用

a . 光譜測量

在開發(fā)新的熒光蛋白/染料或對植物葉片等自發(fā)熒光較強的樣品成像時，熒光蛋白/染料的激發(fā)和發(fā)射光譜就顯得尤其重要。通過共聚焦這一利器能輕松實現(xiàn)對熒光蛋白/染料發(fā)射光譜的掃描，而配備最新的白激光激光器后，熒光蛋白/染料激發(fā)和發(fā)射光譜的同時掃描在分分鐘內(nèi)就能輕松搞定。

圖8 通過白激光激光器對六色熒光小球樣品激發(fā)和發(fā)射光譜的同時掃描。

b .  FRAP

（Fluorescence Recovery After Photobleaching）

借助于高強度激光照射細胞的某一區(qū)域使該區(qū)域熒光分子發(fā)生光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴散，用激光掃描共聚焦顯微鏡可直接對此擴散速率進行檢測，由此可以研究生物膜流動性、細胞骨架動力學、細胞內(nèi)及細胞間的物質交流等。

圖9 熒光漂白恢復技術（FRAP的實現(xiàn)過程。

c . FRET

（Förster resonance energy transfer）

熒光共振能量轉移發(fā)生在供體熒光分子與受體熒光分子的距離足夠近且供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜相重疊時（10nm以內(nèi)）。當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過共振實現(xiàn)能量向鄰近受體分子轉移的現(xiàn)象。發(fā)生FRET后，供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強。通過FRET可以檢測分子間的相互作用及分子的折疊與構象變化。

圖10熒光共振能量轉移技術（FRET）的原理。

以上高級功能的應用都可通過選擇拍攝軟件中的相應模塊快速的實現(xiàn)。

小結

共聚焦顯微鏡作為科研中的尖兵利器，其應用還遠不止上面提到的這些。而徠卡新一代頂級共聚焦顯微鏡Leica TCS SP8 X配備了白激光激光器（獨有的AOBS分光系統(tǒng)）、棱鏡分光狹縫檢測系統(tǒng)、AFC自動對焦裝置、超高靈敏檢測器HyD（配合白激光可實現(xiàn)高清晰度高分辨率的門控成像）、Hyvolution圖像處理軟件（通過反卷積處理可達到130nm高分辨率）等，能輕松實現(xiàn)以上所有應用。同時，其強大的擴展性使SP8能輕而易舉升級為STED超高分辨率顯微鏡、MP多光子成像系統(tǒng)、Hi speed高速掃描系統(tǒng)等進而實現(xiàn)更多更強大的應用，可以說SP8 X共聚焦顯微鏡作為科研界的尖兵利器當之無愧。