細(xì)胞體外暴露染毒技術(shù)的發(fā)展與展望

一、簡介：

不斷進(jìn)行的工業(yè)發(fā)展和新技術(shù)改進(jìn)應(yīng)用（例如，納米技術(shù)），都導(dǎo)致了空氣污染的不斷增加，導(dǎo)致了肺部疾病在過去幾十年里大大的增加。新的產(chǎn)品（例如，納米粒子的噴霧劑）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在電氣工業(yè)，日常消費(fèi)和醫(yī)療應(yīng)用等等特別是噴霧或粉末形式應(yīng)用的產(chǎn)品，對人體健康被認(rèn)為是特別有害的。由于增加了有害物質(zhì)的釋放，如，當(dāng)使用納米噴霧劑的鞋護(hù)理，清潔劑，抗菌噴霧劑，或在塑料等產(chǎn)品的技術(shù)加工過程，也就明顯增加肺部暴露機(jī)會。然而，對可吸入物質(zhì)的毒性及基本病理機(jī)制的研究卻了解甚少。自2006以來，歐盟化學(xué)品監(jiān)管規(guī)定（注冊，評估，授權(quán)和限制化學(xué)品，歐共體1907 / 2006），要求對現(xiàn)有的以及新推出的化學(xué)品進(jìn)行毒性風(fēng)險(xiǎn)評估，包括鑒定其潛在的吸入毒性危害。人體內(nèi)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)是罕見的，因?yàn)槿祟愔卸就ǔＪ桥既坏�，不可預(yù)測的，和不可控制的。具有相同或類似的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)據(jù)是非常困難的。此外，社會道德的原因，在人體內(nèi)開展肺毒性的研究也是不可行的。因此，毒理學(xué)數(shù)據(jù)通常在動物實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生。然而，動物模型也具有其局限性，例如種間差異。此外，立法需要考慮“3R”原則（減少，優(yōu)化，和替代）及其發(fā)展，即需建立和驗(yàn)證可替代目前動物試驗(yàn)的方法。因此，一種以體外實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的體外暴露染毒技術(shù)，進(jìn)行肺毒理性評價(jià)研究是必須的。

二、細(xì)胞體外暴露染毒技術(shù)

1. 浸沒式體外暴露染毒

各種體外培養(yǎng)模型已經(jīng)被用來進(jìn)行空氣中氣溶膠的急性毒性評價(jià)與研究。傳統(tǒng)浸沒式體外暴露染毒技術(shù)，是最簡單有效的一種體外暴露染毒研究方法，到目前為止，仍有許多實(shí)驗(yàn)室正在使用。該方法首先是把細(xì)胞進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)，然后把需要暴露的氣溶膠物質(zhì)需溶于培養(yǎng)液后到達(dá)細(xì)胞表面，通過細(xì)胞與培養(yǎng)液相互作用的方式進(jìn)行進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)（如圖1所示）。

圖1 浸沒式體外暴露染毒模式圖

但是，對于肺內(nèi)上皮細(xì)胞，這種方式有別于真實(shí)的氣液界面暴露環(huán)境：1、暴露在浸沒條件下進(jìn)行，導(dǎo)致氣溶膠特性存在潛在改變的可能；2、對于不溶于水的固體顆粒物，其在培養(yǎng)液中分布的均勻性較低；3、相比較于氣體，顆粒物在液體中的運(yùn)動速度降低，與細(xì)胞接觸的效率降低。

2. 氣液界面體外暴露染毒

由于浸沒式體外暴露然染毒存在先天的缺陷，科學(xué)家們開始探索一種新的能夠更加真實(shí)模擬體內(nèi)生物效應(yīng)的體外暴露染毒技術(shù)。早在1975年，Voisin等人提出的氣液界面體外暴露染毒（ALI）的描述，這一描述為體外培養(yǎng)肺細(xì)胞的氣液界面暴露（ALI）提供了依據(jù)。這一理論中細(xì)胞既可以通過底膜獲取培養(yǎng)基，保證了細(xì)胞的體外存活率，又可實(shí)現(xiàn)與頂部與氣體（含受試物質(zhì)氣溶膠）直接暴露。

圖2  氣液界面體外暴露染毒模式圖

2.1 第一代氣液界面細(xì)胞暴露染毒裝置CULTEX：1999年，根據(jù)Voisin等人的描述和Tarkington等人關(guān)于動態(tài)暴露染毒的概念，德國漢諾威醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教授Dr. Ulrich Mohr、Dr. Michaela Aufderheide等人，成功開發(fā)了第一代體外細(xì)胞培養(yǎng)與暴露的染毒的裝置，即基于線性流的體外暴露染毒模塊Cultex CG（如 圖3）

圖3 CULTEX CG  (線性流體外暴露染毒系統(tǒng)Linear Flow System)

第一代氣液界面體外暴露染毒系統(tǒng)，主要特點(diǎn)是氣路呈線性流分布。主要結(jié)構(gòu)有上下兩個(gè)模塊，兩模塊形成緊密的封閉系統(tǒng)。其中下部模塊為細(xì)胞培養(yǎng)部分，實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)小室置于其中，小室底部具備37℃水浴及可流動的培養(yǎng)基供給；上部是與培養(yǎng)小室對應(yīng)分布的線性的氣體進(jìn)出模塊，通過在后端連接的抽氣泵，在密閉腔室內(nèi)實(shí)現(xiàn)負(fù)壓，所需暴露物質(zhì)不停進(jìn)入密閉系統(tǒng)內(nèi)完成暴露染毒后才從后端排出。細(xì)胞培養(yǎng)小室中形成良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，其中的細(xì)胞并可與頂部進(jìn)來的氣體進(jìn)行直接接觸，實(shí)現(xiàn)直接的氣液界面暴露。

2.2 第二代氣液界面細(xì)胞暴露染毒裝置CULTEX RFS：

在受試物為氣體時(shí)，氣路設(shè)計(jì)是否為線性排列，并不重要，因?yàn)�，氣體的分布是均勻的。但當(dāng)受試物為顆粒物氣溶膠時(shí)，由于其具有復(fù)雜顆粒物粒徑大小分布及物理化學(xué)性質(zhì)，其線性方向運(yùn)輸將對其顆粒物的沉積產(chǎn)生非常大的影響。（1）顆粒物濃度及粒徑分布在稀釋系統(tǒng)中的穩(wěn)定性收到影響；（2）在不同的細(xì)胞小室上沉積的粒子濃度及粒徑將發(fā)生變化，導(dǎo)致在不同的細(xì)胞小室內(nèi)沉積顆粒的平行性和重復(fù)性較差。顯然，壓縮空氣的進(jìn)氣稀釋是無法打破受試物質(zhì)的層流分布，這將無法改變?nèi)缟纤�述沉積效應(yīng)的產(chǎn)生。

考慮到這些缺點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)小室和氣溶膠入口分布需要進(jìn)行根本性的改變。為了避免受試顆粒物暴露的不均勻性，Cultex推出全新概念的二代暴露染毒模塊Cultex RFS（圖4、圖5）。

  圖4  CULTEX  RFS外觀圖            圖5  CULTEX  RFS內(nèi)部氣路圖

在這里，氣溶膠將通過一個(gè)帶有噴嘴(Mohr, 2013)的中央入口統(tǒng)一進(jìn)入，在噴嘴處氣溶膠將均勻分散到三個(gè)中央輻射分布的通道內(nèi)，通過該通道進(jìn)入輻射分布的細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)，如此過程后，氣溶膠在三個(gè)細(xì)胞小室內(nèi)沉積的均一性和重復(fù)將大大提高。該實(shí)驗(yàn)中不同顆粒沉積后的圖片和數(shù)據(jù)結(jié)果都顯示了非常好的效果，三個(gè)細(xì)胞小室間顆粒沉積偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差都非常理想。與第一代線性流系統(tǒng)比較，我們發(fā)現(xiàn)二代輻射流暴露染毒模塊損失了部分顆粒，即每個(gè)細(xì)胞小室內(nèi)沉積顆�？傎|(zhì)量在減少。這是由于Cultex RFS模塊中我們增加了大顆粒物（凝聚粒子）預(yù)分離技術(shù)，降低了大的或凝聚在一起的顆粒沉積到細(xì)胞表面的可能，即提供了顆粒物粒徑分布的均一性，使實(shí)驗(yàn)受試物更穩(wěn)定，既減小了粗顆粒對實(shí)驗(yàn)的影響，又進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.3 第三代氣液界面細(xì)胞暴露染毒裝置CULTEX RFS COMPACT：

圖6  COMPACT結(jié)構(gòu)圖

氣液界面細(xì)胞暴露染毒發(fā)展到第二代技術(shù)CULTEX RFS，已經(jīng)具有非常高的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性，但在實(shí)際應(yīng)用中仍有一些問題，比如通道數(shù)量較少，只有3個(gè)暴露通道，且所有通道暴露同一氣溶膠物質(zhì)，缺少對照實(shí)驗(yàn)組。為此德國CULTEX實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司在2015年推出第三代氣液界面細(xì)胞暴露染毒裝置CULTEX RFS COMPACT（見圖6），COMPACT繼承了CULTEX RFS的輻射流設(shè)計(jì)等主要優(yōu)點(diǎn)外，增加了細(xì)胞暴露腔室數(shù)量達(dá)6個(gè)，共分為兩組，進(jìn)行對比試驗(yàn)。同時(shí)優(yōu)化減少了每個(gè)腔室細(xì)胞培養(yǎng)基加入量，整體采用電加熱恒溫系統(tǒng)，更靈巧便捷，易于進(jìn)行室外大氣試驗(yàn)。

這便是氣液界面細(xì)胞暴露染毒技術(shù)的發(fā)展過程，在早期主要是細(xì)胞系（如A549）以及原代細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）被用于在急性吸入毒理學(xué)領(lǐng)域的劑量-反應(yīng)關(guān)系的建立。隨著時(shí)間的推移，體外暴露染毒系統(tǒng)已經(jīng)變得越來越復(fù)雜，現(xiàn)在已經(jīng)可以用于對呼吸道不同部位分化培養(yǎng)的3D細(xì)胞進(jìn)行體外暴露染毒研究，特別是近期CULTEX推出的Insert Cup裝置，可以很好的在體外建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型。CULTEX復(fù)雜的體外暴露染毒系統(tǒng)的發(fā)展也為毒理學(xué)測試策略開辟了新的領(lǐng)域。除了在急性吸入毒理學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)形成穩(wěn)定的驗(yàn)證方法外，多次重復(fù)體外暴露染毒概念，特別是無毒劑量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在亞急性試驗(yàn)領(lǐng)域得到開展。

目前，體外暴露染毒技術(shù)的主要興趣是：在體外更真實(shí)的模擬人類體內(nèi)的生物效應(yīng)，開展各種指定實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的體外暴露染毒實(shí)驗(yàn)。