冷凍電鏡結合 Nanodisc在膜蛋白研究的應用

細胞生物膜所含的蛋白稱為膜蛋白，其參與和行使了眾多細胞功能，包括細胞與外界進行物質運輸、信息傳遞、能量交換等。膜蛋白擔任了各種神經(jīng)信號分子、激素和其他底物的受體，構成了各種離子跨膜的通道，以及構成各類轉運蛋白。在人體蛋白中，有大約 30% 是膜蛋白。FDA 批準的新藥中，絕大多數(shù)都以膜蛋白為靶點。

隨著對膜蛋白工作機理的深入研究，新的細胞調控作用靶點不斷被發(fā)現(xiàn)，從而使作用于靶點的新藥能更有針對性地被開發(fā)出。例如現(xiàn)在市面上有不少基于細胞轉運通道蛋白設計的藥物，最常見一類抗高血壓藥（如氨氯地平），其主要功能是鈣離子通道阻滯劑，選擇性的同離子通道結合以阻滯鈣離子進入細胞，從而導致心肌收縮力減弱、心率減慢和血管擴張等以達到降壓的作用。膜蛋白結構是設計并開發(fā)靶向作用于膜蛋白藥物的重要依據(jù)，但目前已被研究清楚結構的膜蛋白僅占膜蛋白總量的 1%。這是因為膜蛋白依附或橫跨在細胞膜的磷脂雙分子層上，所以膜蛋白的純化、結構的解析等都極具挑戰(zhàn)性。 

對蛋白包括膜蛋白結構的解析和研究是蛋白研究的基礎， X 射線晶體學、核磁共振（NMR）和冷凍電鏡（Cryo-EM）被稱作結構生物學研究的三大利器，在現(xiàn)今已解析的膜蛋白結構中，90% 以上都采用的是 X 射線晶體學方法，而核磁共振在小分子量的蛋白結構解析中發(fā)揮了重要的作用。數(shù)十年里，X-射線晶體學一直是解析蛋白質結構的首選方法。然而 X 射線晶體學方法對樣品要求很高，需要得到具有衍射能力的蛋白晶體。但許多的蛋白質，尤其是膜蛋白和蛋白質復合物卻難以結晶。而另一方面，NMR 可用來解析較小的蛋白的結構（一般不超過 30 kDa），但較難用于分子量較大蛋白的結構解析。在之前的很長時間里，冷凍電鏡由于其解析結構的分辨率較低，一直未能得到廣泛的應用。近年來，冷凍電鏡領域里硬件和算法的突破性進展使得現(xiàn)在能夠利用 cryo-EM 解析近原子分辨率的結構，及大地促進了結構生物學的發(fā)展。

不同于晶體學，cryo-EM 所需的樣品量很少、無需生成晶體而只需保持水溶液環(huán)境下穩(wěn)定。在 2013 年末，美國加州大學舊金山分校的程亦凡教授與同事 David Julius 合作，利用單電子計數(shù)探測器，以近原子分辨率 (3.4 Å)，確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白 TRPV1 的結構。這一研究成果讓相關領域工作者開始重新審視冷凍電鏡在結構生物學研究中的所能發(fā)揮的作用。這對于一些難結晶的蛋白質，特別是膜蛋白的結構生物學研究提供新的契機。隨著不斷的嘗試，利用冷凍電鏡對膜蛋白結構解析的成果也越來越多，作為藥物研發(fā)方面的應用，要分析小分子與蛋白質的互作，而且分辨率越高越好�，F(xiàn)在 Subramaniam 等人達到了 cryo-EM 成像迄今為止的最高分辨率（2.2 Å），此前只有 X 射線晶體衍射達到過這種水平的分辨率，這能為人們提供足夠的結構信息，進行更好的藥物研發(fā)。
 

圖 1：分辨率對觀測結果的影響（左）不同分辨率對應能測定的分子結構（右）
（圖片來源：Elad Binshtein, Melanie D. Biochemistry, 2015）

膜蛋白基本可分為三大類：整合膜蛋白、外周膜蛋白和脂錨定蛋白。整合膜蛋白占膜蛋白種類的 70%～80%。外周膜蛋白一般為水溶性，相對容易分離和純化，也較易獲得結晶供 X 射線衍射分析。難于研究的是整合膜蛋白，由于其具有疏水的跨膜區(qū)域，因此直接暴露在水溶液環(huán)境下非常不穩(wěn)定，因此需要添加去污劑進行穩(wěn)定。而當用去污劑保護膜蛋白進行結構解析和功能研究時，又會因為膜蛋白離開其天然磷脂雙分子而丟失有關脂質互作及它們對蛋白結構影響這一層重要信息。這尤其對需要脂質起結構和調節(jié)作用的蛋白質有較大影響。另外，不合適的去污劑會使膜蛋白不穩(wěn)定，且去污劑膠束與磷脂分子的結構差異及水脂界面彎曲度在某些情況下可能造成膜蛋白結構的改變。

為了更好地讓膜蛋白能夠穩(wěn)定在水溶液環(huán)境下通過冷凍電鏡進行結構解析，且避免去污劑會帶來的潛在影響，作為模擬細胞膜磷脂雙分子層結構的 Nanodisc 是保證實驗結果不受各種不確定因素影響的解決方案。Nanodisc 最早由 UIUC 的 Stephen Sligar 教授提出，其由膜支架蛋白 (membrane scaffold proteins, MSPs) 和磷脂分子構成的磷脂雙分子層類膜結構。Nanodisc 的理化性質與細胞膜磷脂雙分子層相似，且膜蛋白可以整合到 Nanodisc 中，最大限度地保持其結構穩(wěn)定和生物學活性，為膜蛋白的研究提供了有力的技術支持。膜支架蛋白（MSPs） 是載脂蛋白（apo）A-I 的縮減版，它們包繞著脂質雙分子層從而形成圓盤狀的結構，即 Nanodisc。其包含一個朝向內部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結構使得 Nanodisc 在水溶液中具有很高的溶解度，同時具有非常高的穩(wěn)定性。通過 Nanodisc 包裹，純化后的膜蛋白在保持空間結構穩(wěn)定和活性的同時，也將模擬膜蛋白原有在細胞膜上的狀態(tài)，跨膜域被包埋在磷脂雙分子層內部。
 

 
圖 2：膜蛋白組裝到 Nanodiscs 的原理圖。
綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白
（圖片來源 Cube Biotech 官方網(wǎng)站）

將膜蛋白組裝到 Nanodiscs 中主要有兩種方法。
 

• 第一：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白在去污劑存在條件下將膜蛋白純化，然后再添加 MSPs 和磷脂。含有膜蛋白的 Nanodiscs 能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
• 第二：Nanodiscs 與無細胞表達體系相結合，針對于一些特殊蛋白，例如帶有毒性的蛋白可通過無細胞表達體系表達，通過加入已經(jīng)預先組裝的 Nanodiscs 使表達出的膜蛋白通過自組裝鑲嵌進去。

圖 3：膜蛋白與 Nanodisc 的兩種組裝機制
（圖片來源 Cube Biotech 官方網(wǎng)站）

左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的 MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc 復合物。
右圖：預組裝了 MSP 與磷脂的 Nanodisc 加入到無細胞反應液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發(fā)地組裝到 Nanodisc 中。

結合 Nanodisc 和冷凍電鏡這兩項技術，越來越多的膜蛋白結構得以解析。其中較有代表性的包括程亦凡教授通過闡明 Nanodisc 中 TRPA1 的結構揭示了配體和脂質的作用機制，確定了環(huán)狀脂質和調節(jié)脂質的定位，證實通過形成一種三元復合物，特異的磷脂互作促進了一種蜘蛛毒素等相關配體結合 TRPV1，相關成果發(fā)表在 2016 年 Nature 上。 此外由于 Nanodisc 還可以實現(xiàn)在同一個 Nanodisc 上實現(xiàn)寡聚、二聚和單體的鑲嵌，來自歐洲的 Rouslan G 及其合作者在 Nanodisc 上鑲嵌 ryanodine 受體四聚體使用冷凍電鏡實現(xiàn)了結構解析，相關成果也發(fā)表在 2015 年 Nature 雜志上。相信伴隨著冷凍電鏡解析能力的不斷提升，以及如 Nanodisc 穩(wěn)定膜蛋白和還原膜蛋白天然環(huán)境技術的不斷出現(xiàn)，膜蛋白結構解析和功能研究將會迎來全新的發(fā)展。
 

 
圖 4：通過冷凍電鏡解析 Nanodisc 包裹 TRPA1 蛋白結構，b、c 灰色部分為 Nanodisc
（圖片來源于程亦凡 2016 Nature 文章）

 
圖 5：通過冷凍電鏡解析 Nanodis 包裹 ryanodine 受體四聚體結構，灰色部分為 Nanodisc
（圖片來源于 Rouslan G 2015 Nature 文章）

參考：

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