引物合成的步驟及方法介紹

   Oligo DNA的人工化學(xué)合成始于50年代初期，1980年，全自動(dòng)的固相DNA合成儀面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成為可能，這大大地推動(dòng)了生物工程技術(shù)的蓬勃發(fā)展。

   現(xiàn)在一般都采用β-乙腈亞磷酰胺化學(xué)合成Oligo DNA，將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的合成時(shí)從3' →5' 方向進(jìn)行，通常3' 端的第一個(gè)堿基結(jié)合在Glass擔(dān)體 (Controlled Pore Glass，CPG)上。其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。

合成步驟
  Step1：脫掉附加在CPG擔(dān)體上的第一個(gè)堿基5' -OH基團(tuán)上的保護(hù)基 (DMTr)，準(zhǔn)備附加下一個(gè)新的堿基；
  Step2：活化新的堿基單體 (Phosphoramidite)，準(zhǔn)備與第一個(gè)堿基進(jìn)行反應(yīng)；
  Step3：第二個(gè)堿基與第一個(gè)堿基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；
  Step4：將沒有反應(yīng)的第一個(gè)堿基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再進(jìn)一步參與反應(yīng)；
  Step5：將核苷亞磷酸酯氧化成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯 (即將三價(jià)磷氧化成五價(jià)磷)。
  Step6：重復(fù)進(jìn)行Step1～Step5的循環(huán)，直至合成完所需的Oligo DNA序列。
  Step7:合成結(jié)束后，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

圖1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一個(gè)堿基，N2代表第二個(gè)堿基，依此類推。

OD數(shù)的確定

   一般PCR擴(kuò)增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯(cuò)的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，也是一種浪費(fèi)。

引物純度檢測

   實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

引物級(jí)別選擇