引物純化的方法有哪些

   如今，引物純化方式多種多樣。各位科研君，每天忙碌奔波于核酸提取、載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)等環(huán)節(jié)，沒(méi)有深入了解過(guò)各種引物純化方式吧！今天，小編帶各位對(duì)各種引物純化方式作下對(duì)比。各位科研君在以后的研究中，記得對(duì)號(hào)入座哦！

一般純化方式

   目前，采用的主打的引物純化方式是脫鹽純化。其只能純化掉引物中的鹽分，并不能去除含的小片段，價(jià)格較為便宜，能滿足一般常規(guī)的應(yīng)用。

1. C18柱：

   又稱為簡(jiǎn)易反相柱，對(duì)DNA有特異性吸附，可被有機(jī)溶液洗脫，但不會(huì)被水洗脫。因此能有效地去除鹽分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。該方法一般不會(huì)對(duì)普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對(duì)于需要用于測(cè)序、克隆的引物不能使用這個(gè)級(jí)別。

2. OPC純化：

   采用寡核苷酸純化柱 (Oligonucleotide Purification Cartridge，OPC)純化，制品純度保證80 ~ 90%。此級(jí)別制品可用作PCR引物、DNA測(cè)序引物、各種探針等。該級(jí)別只提供長(zhǎng)度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更長(zhǎng)時(shí)，制品的純度得不到保證。

3. HAP純化方法

   HAP（High Affinity Purification）其原理是利用合成引物5'-端DMT基團(tuán)對(duì)HAP樹(shù)脂專一性吸附，而不含DMT的短鏈DNA不被吸附，從而達(dá)到分離純化的目的。制品純度可達(dá)到80~90%，可以滿足雜交探針、測(cè)序、常規(guī)PCR（不再做進(jìn)一步克隆實(shí)驗(yàn)）等用途了。但是因?yàn)槠鋵Ｒ恍晕��?DMT 能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負(fù)載量小。特別是對(duì)長(zhǎng)于39 堿基以上的片段純化效果不好。此級(jí)別只提供長(zhǎng)度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更長(zhǎng)時(shí)，制品的純度得不到保證。

4. RPC純化

   RPC純化是通過(guò)反相凈化濾芯 (Reverse Phase Cartridge) 對(duì)引物進(jìn)行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，RPC是一種有效且更加經(jīng)濟(jì)的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質(zhì)如 C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，并且可以用水輕松地將切割下來(lái)的保護(hù)基團(tuán)和短的引物片段從反相柱上洗掉。RPC純化的引物可以應(yīng)用于DNA測(cè)序、 PCR及基因合成等。

5. TON純化

   基于特異和反相層析法，從合成好的產(chǎn)物中去除失敗序列，提供最終的目標(biāo)序列。適于35個(gè)堿基以下的引物。毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis）純度大于75%。

PAGE純化方式

PAGE純化價(jià)格適中，純度較高，能滿足大多數(shù)應(yīng)用，尤其是長(zhǎng)度大于50個(gè)堿基的長(zhǎng)鏈引物。

1. 經(jīng)典PAGE純化：

   PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)，該方法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化基于尺寸和構(gòu)象分離全長(zhǎng)產(chǎn)物和失敗序列，可以分離相差一個(gè)堿基的引物(120堿基以內(nèi))，從而提供高純度的引物。純化后的DNA純度大于90%，相比與其他純化方法，PAGE純化對(duì)長(zhǎng)鏈Oligo DNA (大于50 mer)的純化特別有效，制品純度保證90 ~ 95%。如訂購(gòu)的DNA欲用作RT-PCR引物、各種探針，或用于PCR克隆測(cè)序、定點(diǎn)突變等，請(qǐng)選用PAGE純化制品。

2. ULTRA PAGE純化：

   理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。經(jīng)過(guò)PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶往往比較寬，帶與帶之間有重疊，分辨率有所下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬，很難避免割到差別僅一個(gè)或幾個(gè)堿基的引物。因此，將原有的PAGE純化方式升級(jí)優(yōu)化為現(xiàn)在的ULTRA PAGE純化方式，即在PAGE純化的同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì)DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。

HPLC純化方式

   價(jià)格最高，純度也最好，適用于小于40個(gè)堿基的未修飾寡核苷酸，用于定點(diǎn)突變、克隆、蛋白結(jié)合凝膠遷移電泳分析、治療用途。
   HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。