染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)的難點
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，可以真實地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就最基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。
1. 細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時。需注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。
2. 染色質(zhì)片段化
交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600 bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識別，其片段破碎的均勻一致性對結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進而影響ChIP的效率。而來自比利時的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時外接水循環(huán)儀保證了實驗的溫度穩(wěn)定性，成為目前ChIP實驗的首選。
3. 染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)
Input對照：
在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的檢測。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。
Beads選擇：
接下來，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體特異反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。
抗體選擇：
染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關(guān)鍵。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時，抗體的抗原表位可能因為與結(jié)合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。
陰性對照設(shè)置：
在做ChIP實驗時，需設(shè)置對照，以便于對實驗結(jié)果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是最基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。最佳的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗的檢測。
4. 交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化
用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質(zhì)，進行分析。
5. DNA的鑒定
最常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區(qū)域序列多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同，因此可設(shè)計多對引物來反復(fù)驗證ChIP實驗的結(jié)果.
