冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑盒使用說明

冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過熒光染料甲酚紫標(biāo)記的多肽底物作為探針，自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，受到組織蛋白酶B水解后，呈現(xiàn)熒光現(xiàn)象，以分析樣品酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍組織內(nèi)組織蛋白酶B的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細(xì)胞器內(nèi)，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標(biāo)蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞外蛋白通過內(nèi)吞進(jìn)行周轉(zhuǎn)中起著重要作用，同時也是啟動和傳遞細(xì)胞凋亡信號的替代機(jī)制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細(xì)胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用。細(xì)胞間接觸和細(xì)胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常，將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。使用熒光標(biāo)記的特異性底物可以探測組織蛋白酶B的特異活性。熒光染料甲酚紫（cresyl violet）上基團(tuán)，通過酰胺（amide linkage）與人工合成的二肽化合物組織蛋白酶B底物RR（Arg-Arg；精氨酰精氨酰）雙重替換后，受到組織蛋白酶B的水解后，釋放出具有紅色熒光的單一基團(tuán)替換或無替換的甲酚紫，以此進(jìn)行熒光（激發(fā)波長510至560nm，散發(fā)波長570至620nm波長）檢測組織蛋白酶B的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

染色液（Reagent A）     20微升

稀釋液（Reagent B）      1毫升

清理液（Reagent C）     20毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞熒光定性分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）室溫下預(yù)熱。然后移出2微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入200微升稀釋液（Reagent B），混勻后，室溫下靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備2片待測的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片（注意：建議使用異戊烷快速冷凍制片）
• 置于室溫下，小心加上200微升預(yù)冷的清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加上100微升室溫預(yù)熱的含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液，鋪滿整個切片表面
• 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)；可以蓋上蓋玻片孵育）
• 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
• 小心加上200微升清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察 ：濾波器激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長610nm ――如果紅色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明組織蛋白酶B活性增強(qiáng)

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（0.1毫升工作液）操作
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 建議使用正常組織切片作為陰性對照，顯示微弱的背景信號
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
• 用戶可以使用510至560nm激發(fā)波長和570至620nm散發(fā)波長的任一波長進(jìn)行檢測
• 用戶可以使用赫斯特33342（Hoechst33342）進(jìn)行復(fù)染，終濃度為1微克/毫升
• 孵育時，必須避免光照
• 本公司提供系列組織蛋白酶熒光染色分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰