使用SpectraMax多功能微孔板讀板機進行cAMP HiRange檢測
簡介
在這篇應用文獻中，我們展示了如何用SpectraMax®i3、SpectraMax®Paradigm®和SpectraMax®M5e多功能微孔板讀板機進行可靠的、高通量的HTRF®檢測，并具有完美的Z’因子和高重復性的EC50值。
HTRF®是CisbioBioassays公司開發(fā)的一項檢測生物分子相互作用的多用途技術(shù)1。這項技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)和時間分辨(TR)熒光測定，可消除短壽命的背景熒光。這一檢測使用供體和受體熒光基團。當供體和受體彼此足夠接近時，能量源(如氙閃燈)激發(fā)供體使能量轉(zhuǎn)移到受體上，受體發(fā)射出特定波長的熒光。
HTRF使用4種專門的熒光基團，能夠組合成一對供體-受體TR-FRET基團。供體為銪(Eu3+)的穴狀化合物和鋱(Lumi4TM-Tb)的穴狀化合物，其長壽命熒光可以用于時間分辨熒光檢測中1。兩種受體分別為XL665和d2，用于HTRF檢測中。這兩種受體的激發(fā)光譜均與HTRF供體的發(fā)射光譜重疊。每個受體的發(fā)射峰都在665nm且供體在這一范圍內(nèi)沒有發(fā)射光或發(fā)射光很弱。最初的HTRF受體XL665，是一種從紅藻中純化出的藻膽蛋白色素。第二代受體d2是一種經(jīng)過修飾的別藻藍蛋白，比XL665小100倍且可以減少可能在XL665檢測中出現(xiàn)的空間位阻問題。
HTRF cAMP HiRange試劑盒能夠在細胞樣品中對環(huán)腺苷酸(cAMP，環(huán)腺苷3’，5’ 一磷酸)進行定量。cAMP在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號轉(zhuǎn)導中是一種關鍵的第二信使。當配體結(jié)合到GPCR，構(gòu)想改變就會發(fā)生，激活受體接著激活G蛋白。進一步的信號轉(zhuǎn)導取決于激活的G蛋白類型。Gs的激活導致腺苷酸環(huán)化酶調(diào)控cAMP的上調(diào)。細胞中產(chǎn)生的自由cAMP與d2-標記的cAMP競爭性結(jié)合抗cAMP穴狀化合物抗體，因此，細胞內(nèi)cAMP的增加會導致FRET降低，偵測到的665nm熒光發(fā)射也會下降(圖 1)。
優(yōu)勢
- 高度可靠的均相實驗
- Z’ 因子 ≥ 0.9
- 流程式且穩(wěn)定的高通量(HTS)檢測
- SoftMax Pro軟件預設實驗模板快速獲得結(jié)果
材料
- cAMP HiRange 1000 測試
(Cisbio P/N 62AM6PEB)
- 黑色和白色低體積384-孔微孔板
(Greiner P/N 784076 和 784075)
- SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機
(Molecular Devices)
- SpectraMax Paradigm 多功能微孔板
讀板機(Molecular Devices)
- SpectraMax M5e 多功能微孔板讀板機
(Molecular Devices)
- HTRF 檢測卡盒
(Molecular Devices P/N 0200-7011)
方法
HTRF cAMP HiRange試劑盒由CisbioBioassays公司提供。按照cAMP HiRangeHTRF藥品說明書準備終濃度范圍從0.17nM到2800 nM的cAMP標準品。不含cAMP的陽性質(zhì)控(最大FRET)和不含cAMP或cAMP-d2的陰性質(zhì)控包含在內(nèi)。按照表1中所述，每孔添加20 μL試劑。
數(shù)據(jù)分析
使用Cisbio專利的基于雙發(fā)射波長檢測的比值算法分析HTRF檢測。616nm發(fā)射波長的供體作為內(nèi)參，同時665nm發(fā)射波長的受體作為測定生物學反應的指示。這種比例測定減少了孔與孔之間的差異并降低了化合物干擾。在第4步計算的Delta F反映了測定時的信號相對于背景大小，用于內(nèi)部測定的比較。結(jié)果通過665 nm/616 nm比值計算，以如下Delta F表示：
Z’ 因子由陰性(無cAMP，無cAMP-d2)和陽性質(zhì)控(無cAMP)計算得到2。
利用SoftMax® Pro軟件生成和分析數(shù)據(jù)，包含一些預設的HTRF實驗模板以簡化檢測和分析。
結(jié)果
使用SoftMax Pro軟件的4-參數(shù)曲線擬合如上所述進行數(shù)據(jù)分析和做圖。依據(jù)表2的讀板機參數(shù)設置獲得最佳結(jié)果。當延遲時間、整合時間和脈沖數(shù)增加，會觀察到DF%的下降。與白色微孔板(圖2)相比，使用黑色低體積384-孔微孔板可使檢測窗從3020增加到3253。然而，Z’ 因子，考慮到陽性和陰性質(zhì)控的檢測窗和標準差以及EC 50值在兩個孔板類型中非常相似(表3)。(注意：當使用SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機，需要白色孔板。)
SpectraMax i3和SpectraMax Paradigm讀板機在逐一比較相同測試孔板時得到的結(jié)果基本一致(圖3)。針對這一測試，利用了白色微孔板。檢測窗為3004和3051，且Z’ 因子分別是0.92和0.90。EC50值是19.1nM，相比于發(fā)布值(表3)。SpectraMaxM5e多功能微孔板讀板機得到相似的Z’因子和EC50值。
SpectraMax Paradigm讀板機得益于雙PMT配置而比其他讀板機更快，使之可以同時讀取兩個HTRF發(fā)射波長(表3)。
總結(jié)
SpectraMaxi3和SpectraMaxParadigm讀板機可配置具有高通量篩選能力且HTRF認證的檢測卡盒。當在SpectraMaxParadigm讀板機上使用時，此卡盒能進行雙發(fā)射同時檢測從而加快讀數(shù)速度。在三個讀板機中，cAMPHiRange測定得到的完美Z’因子表明了多功能檢測系統(tǒng)的可靠性能。采用SoftMaxPro軟件自帶的HTRF預設實驗模板大大簡化了數(shù)據(jù)采集和分析。
參考
1. http://www.htrf.com/htrf-technology
2. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg,K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthrough put screening assays J. Biomolecular Screening4(2): 67-73.
