ELISA實(shí)驗(yàn)必看；ELISA試劑盒使用操作要點(diǎn)

ELISA實(shí)驗(yàn)必看；ELISA試劑盒使用操作要點(diǎn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 因其操作簡單，靈敏度高，特異性好，經(jīng)濟(jì)安全等特點(diǎn)而在臨床上廣泛應(yīng)用，但是由于其操作步驟復(fù)雜，一般包括試劑準(zhǔn)備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結(jié)果判定等，其中任何一項(xiàng)操作不當(dāng)都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生很大影響。因此，必須加強(qiáng)ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1 試劑

優(yōu)質(zhì)的試劑是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的基礎(chǔ)。從4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20～30 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布。未用完的試劑和質(zhì)控品應(yīng)密封并及時(shí)放回冰箱保存。根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點(diǎn)，試劑正式啟用前應(yīng)充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調(diào)整其pH 值和離子強(qiáng)度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件，嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免試劑批號改變而重建質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

2 標(biāo)本

患者標(biāo)本中有可能含有干擾試驗(yàn)的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過長及標(biāo)本凝固等。要注意避免標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血，標(biāo)本中血紅蛋白中含有血紅素基因，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記的ELISA測定試驗(yàn)中，容易在溫育過程中吸附于固相，從而與加入的底物反應(yīng)顯色。標(biāo)本在低溫下保存時(shí)間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常血清標(biāo)本可在2～8℃保存1 周，冷凍保存時(shí)間會更長。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融，標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價(jià)下降從而引起假陰性結(jié)果。標(biāo)本的采集及分離要注意盡量避免細(xì)菌的污染。此外，標(biāo)本在凍存時(shí)會因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標(biāo)本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反復(fù)顛倒。

3 操作因素

3.1 加樣

加樣器是一種比較精密的工具，其在長時(shí)間使用時(shí)會因機(jī)械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標(biāo)本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡，加樣時(shí)還應(yīng)注意操作時(shí)差對結(jié)果的影響，尤其對競爭法檢測結(jié)果影響更大。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時(shí)用多道加液器，或者雙人同時(shí)加樣以減少操作時(shí)差對結(jié)果的影響，另外有些項(xiàng)目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應(yīng)。稀釋的方式非常重要，最佳方式是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。

3.2 溫育

3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度�？乖�抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2 h 產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰，為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率。抗原抗體反應(yīng)在4℃更為徹底，形成的產(chǎn)物更多、更穩(wěn)定，但因所需時(shí)間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。

3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（即“邊緣效應(yīng)”）�？蓪�ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應(yīng)板不能重疊放置，防止溫度擴(kuò)散的不均勻性。

3.3 洗滌

洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個(gè)ELISA反應(yīng)過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，卻非常關(guān)鍵。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分，包括未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌液通常為含有一定濃度Tween 20 的緩沖液，Tween 20 是一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，又含疏水基團(tuán)，在洗滌中的作用機(jī)制是借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時(shí)在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子脫離固相而進(jìn)入液相，最終被洗脫。必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05 %Tween20，pH為中性的磷酸鹽緩沖液，如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)的測定下限。洗滌可采用洗板機(jī)或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板內(nèi)注液時(shí)應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機(jī)洗板時(shí)，要保證洗板機(jī)上的每個(gè)吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，要求洗板后殘液小于2 μL，即人工扣板墊紙不濕，浸泡時(shí)間超過45 s。

3.4 顯色

大多數(shù)情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物為過氧化氫，參加反應(yīng)的顯色供氫體有鄰苯二胺（OPD）、鄰聯(lián)甲苯胺（OT）及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等。其中OPD 難溶于水，見光易變質(zhì)，使用前配制，反應(yīng)過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色，目視對比鮮明，其性質(zhì)穩(wěn)定，對人體無毒。若選用各類酸性終止液，則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。TMB作底物時(shí)的產(chǎn)物檢測波長為450 nm ，ALP 作為標(biāo)記物，其底物一般采用對硝基苯磷酸酯（pNPP），產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，吸收波長是405 nm。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須要嚴(yán)格按照試劑盒說明書中規(guī)定的溫度和時(shí)間操作，不可隨意改變溫度和時(shí)間。

3.5 比色

ELISA 顯色結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，不可由肉眼判斷結(jié)果，因?yàn)椴煌瑐�(gè)體的色覺存在差異，尤其是對于乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體這樣的檢測項(xiàng)目，肉眼難以判斷。酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長進(jìn)行測定，包括對顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的2個(gè)吸收峰波長，用非敏感波長清除由于容器上的劃痕、指印、背景等造成的干擾。TMB最大吸收波長為450 nm ，非敏感波長為630 nm ，一般不設(shè)空白孔，否則會出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。加入終止液后應(yīng)盡快比色，否則樣本吸光度值會逐漸下降，顯色越深下降越快，應(yīng)在2 min 內(nèi)比色。

3.6 應(yīng)加強(qiáng)檢測儀器的質(zhì)量控制

如定量移液器要定期校準(zhǔn)；洗板機(jī)要及時(shí)傾倒廢液罐，補(bǔ)充洗滌液，開機(jī)后運(yùn)行沖洗程序（雙蒸水），檢查系統(tǒng)液路系統(tǒng)（有無漏水），檢查吸液和注液速度，關(guān)機(jī)運(yùn)行沖洗程序（雙蒸水），清洗吸針及水箱，儀器外觀清潔；酶標(biāo)儀要定期檢查濾光片是否合格，光源是否穩(wěn)定，機(jī)械系統(tǒng)是否有故障，保持外觀清潔，并定期請廠家工程師進(jìn)行保養(yǎng)維修；水浴箱及存放試劑的冰箱要每天監(jiān)測溫度，并有記錄等。

4 結(jié)果的判定與報(bào)告

4.1 結(jié)果的判定

嚴(yán)格依據(jù)試劑盒提供的陽性判定值（CO）進(jìn)行結(jié)果判定。廠商提供試劑的同時(shí)，說明書上列出的CO值是建立在一系列科學(xué)試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)研究的基礎(chǔ)上，不應(yīng)隨意更改。定量測定需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。

4.2 灰區(qū)的設(shè)置

通常情況下ELISA結(jié)果報(bào)告方式為“陰性”或“陽性”，在二者之間有一條明確的分界線，也就是所謂的陽性判定值即CO值，對于樣本的吸光度值（A）高于CO值就判斷為陽性，相反則判斷為陰性，然而在實(shí)際工作中經(jīng)常會出現(xiàn)樣本A 值位于CO 值附近的人群，即ELISA 檢測的“灰區(qū)”。在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及到“灰區(qū)”的設(shè)置，僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對獻(xiàn)血員的篩查具有較大風(fēng)險(xiǎn)。筆者在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，結(jié)果處于CO值附近的患者重復(fù)性很差，也是容易引起醫(yī)療糾紛的人群。因此對于檢測結(jié)果位于“灰區(qū)”的患者可采用確認(rèn)試驗(yàn)或追蹤檢測方法加以確診。

4.3 標(biāo)本的復(fù)查

ELISA 手工操作過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果差異，因此制定復(fù)查制度及加大復(fù)查力度可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，比如對乙肝“兩對半”處于“灰區(qū)”的標(biāo)本及少見模式的檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。本院在實(shí)際工作中嚴(yán)格執(zhí)行復(fù)查制度，取得了較好的效果。

5 質(zhì)量控制

5.1 室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC） 

要保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，必須做好IQC，首先要保證實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、儀器設(shè)備與硬件設(shè)施必須處于良好的狀態(tài)，其次要對試劑及測定方法過程進(jìn)行理想化，另外實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須經(jīng)過良好的培訓(xùn)。ELISA 定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)。因此質(zhì)量控制要保證試驗(yàn)的靈敏度，目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室定性試驗(yàn)的質(zhì)控規(guī)則還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，較多單位采用“即刻法”，結(jié)合LeveyJennings 質(zhì)控圖的方法。在每塊反應(yīng)板中除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，還要選擇至少2個(gè)室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個(gè)為弱陽性的質(zhì)控品接近CO值，S/CO值應(yīng)該為2～4之間，另一個(gè)為陰性質(zhì)控品。認(rèn)真分析每次IQC失控的原因，定期對各項(xiàng)檢測的均值、變異系數(shù)等進(jìn)行比對分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化，采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邫z測的可靠性。

5.2 室間質(zhì)量評價(jià)（EQA） 

EQA 是一種回顧性評價(jià)，主要是控制實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性。其要點(diǎn)是保證同一患者的標(biāo)本一樣對待室間質(zhì)評物，必須強(qiáng)調(diào)的是EQA結(jié)果必須同IQC一并分析，找出原因，改進(jìn)工作中的不足，同時(shí)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇合適的試劑盒。

綜上所述，ELISA檢測操作步驟復(fù)雜，可能會影響測定結(jié)果的因素較多，分布在測定操作的各個(gè)步驟中，因此必須加強(qiáng)各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，才能得到準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果。