真核生物 18S 基因核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用說明
物種鑒定系列
真核生物 18S 基因核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
請于-20℃條件下保存，有效期 12 個月
◆ 產(chǎn)品說明
物種鑒定系列可針對食品、飼料等樣品中動物源性成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲
線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于真核生物的檢測，檢出限為 0.1%。
◆ 產(chǎn)品組成（48 測試）
|
|
021092M |
|
|
|
|
試劑 |
含量 |
|
A-18S-P |
1000μL ×1 支 |
|
|
|
|
NG-P |
100μL ×1 支 |
|
PG-18S-P |
100μL ×1 支 |
|
|
|
◆ 適用儀器
熒光 PCR 儀（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等 PCR 擴增儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌 1.5mL 或 2.0mL 離心管；②滅菌 0.2mL PCR 管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）
及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：試劑準備區(qū)。
2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。
3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。
★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產(chǎn)生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心 30
秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
◆ 樣品處理
參照《SN/T 3730-2013 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。樣品的采集和制備是動物源性鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應使用一次性消耗品，研缽應經(jīng) 160℃干烤
2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應使用 1%次氯酸鈉溶液浸泡。
取樣應盡量采取肌肉組織，對于同一批樣品，應多點采集合并后，作為一份樣品進行均質(zhì)，提取 DNA。
采樣過程應快速完成，將采取的樣品迅速放入組織攪碎機中進行均質(zhì)成糜狀，充分混勻，取 0.1 g 充分混勻的樣品，采用液氮研磨或均質(zhì)器均質(zhì)。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
將試劑完全解凍，各組分離心 30s。
1.試劑配制（試劑準備區(qū)，放置于冰盒中進行）：
若有 N 個待檢樣品，則參照下表，按照 N+2 個數(shù)量計算反應液用量（N 個待檢樣品+1 個陰性對照+1 個陽性對照），渦旋混勻，離心 30s，分裝于 0.2mL PCR 管中。
|
試劑 |
使用量 |
|
|
|
|
A-18S-P |
20×(N+2)μL |
|
|
|
|
反應液總體積 |
20×(N+2)μL |
|
|
|
2．模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用試劑配套動物源性成分 DNA 提取系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。
3．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進行）
在步驟 1 中已含有反應液的 PCR 管中加入 5μL 模板，順序為 NG-P、待測樣品模板、PG-18S-P。渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進行 PCR 擴增反應。
- 擴增反應（擴增及產(chǎn)物檢測區(qū)）
使用熒光定量 PCR 儀，熒光基團選擇 FAM，淬滅基團選擇 TAMRA。按下列條件設(shè)置擴增反應：
|
|
|
PCR 循環(huán) |
|
|
|
熒光收集位點 |
| |
|
|
95℃ |
10 分鐘 |
|
1 個循環(huán) |
|
|
— |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
95℃ |
15 秒 |
|
40 個循環(huán) |
|
|
— |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
60℃ |
1 分鐘 |
|
|
|
※ |
| |
|
|
|
|
|
|
| |||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5.基線和閾值設(shè)定基線調(diào)整取 3-15 個循環(huán)的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點
◆ 結(jié)果判定
檢測樣品無 Ct 值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有真核生物或含量低于檢測限；
檢測樣品 Ct≤35，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有真核生物；檢測樣品 Ct＞35，可直接報告樣品陰性，不含有真核生物或含量低于檢測限。
- NG 反應為平滑直線，PG 反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
陽性對照
陰性對照
