諾如病毒GI型、GII型RNA核酸檢測試劑盒(IAC，一管式PCR-熒光探針法)使用說明
諾如病毒GI型、GII型RNA核酸檢測試劑盒（IAC，一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產(chǎn)品說明
諾如病毒GI型、GII型RNA核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）參照GB 4789.42-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 諾如病毒檢驗》進行設計，可于一個反應中同時檢測GI型、GII型諾如病毒；適用于貝類生，食蔬菜，胡蘿卜、瓜、堅果等硬質(zhì)表面食品，草莓、西紅柿、葡萄等軟質(zhì)水果等食品中GI型、GII型諾如病毒核酸的檢測。
◆ 產(chǎn)品組成（48測試）
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012172MII |
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試劑 |
含量 |
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A-GIGII |
20μL× 7管×4排 |
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IAC-Nor |
20μL× 5管×4排 |
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B-Nor |
500μL × 1支 |
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PG-Nor |
100μL × 1支 |
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NG-Nor |
100μL × 1支 |
◆ 適用儀器
ABI 系列、MJ 系列、Roche 系列、博日系列以及其它熒光定量PCR 檢測儀（可同時檢測FAM通道（494 nm）、VIC通道（538nm）兩種通道的熒光定量PCR儀）。
◆ 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭（RNase free）；③離心機；④渦旋混勻器。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：試劑準備區(qū)。
2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。
3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。
★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產(chǎn)生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前剪下所需的測試數(shù)，解凍后使用前離心30秒。
5．反應結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
◆ 試劑盒組分及樣品處理說明
（1）樣品前處理請參照GB 4789.42-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 諾如病毒檢驗》進行樣品前處理。
（2）A-GIGII為GI、GII反應液，含有諾如病毒GIGII型引物探針。
（3）IAC-Nor為過程控制反應液，含有過程控制病毒引物探針。
（4）B-Nor為提取過程控制液，進行樣品RNA提取時請參照國標法加入10 μL B-Nor作為提取過程控制；亦可參照國標法另取50-100 μL B-Nor，用PBS緩沖液補足至200 μL，進行核酸提取、標準曲線制作及計算提取效率。
（5）NG-Nor為陰性對照，也可參照國標法提取陰性樣品核酸作為陰性對照進行實驗。
（6）PG-Nor含GI型、GII型諾如病毒核酸，可作為陽性對照，亦可參照國標法作為擴增控制計算抑制指數(shù)。
*推薦使用我們公司的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒中的方案進行病毒RNA的提取，或者采用其他等效產(chǎn)品進行RNA提取。
◆ 實驗操作（推薦）
1. 反應體系配制：（樣本制備區(qū)）
剪下所需測試數(shù)的已含有反應液的PCR管，并參照下表進行編號，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應液中分別加入模板。
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孔編號 |
實驗意義 |
反應液 |
加入模板 |
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A |
空白對照 |
A-GIGII |
5μL RNase free water |
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B |
陰性對照 |
A-GIGII |
5μL陰性對照 |
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C |
病毒提取過程控制1 |
IAC-Nor |
5μL樣品RNA |
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D |
病毒提取過程控制2 |
IAC-Nor |
5μL過程控制病毒RNA |
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E |
病毒提取過程控制3 |
IAC-Nor |
5μL 101倍稀釋過程控制病毒RNA |
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F |
病毒提取過程控制4 |
IAC-Nor |
5μL 102倍稀釋過程控制病毒RNA |
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G |
病毒提取過程控制5 |
IAC-Nor |
5μL 103倍稀釋過程控制病毒RNA |
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H |
擴增控制1 |
A-GIGII |
5μL樣品RNA+1μL擴增控制RNA |
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I |
擴增控制2 |
A-GIGII |
5μL 10倍稀釋樣品RNA+1μL擴增控制RNA |
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J |
擴增控制3 |
A-GIGII |
5μL RNase free water+1μL擴增控制RNA |
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K |
樣品1 |
A-GIGII |
5μL樣品RNA |
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L |
樣品2 |
A-GIGII |
5μL 10倍稀釋樣品RNA |
配制完成后請蓋上PCR管蓋，渦旋混勻并離心后上機反應。
*請參照上表對管進行編號，以免混淆。
2. 擴增反應（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
使用熒光定量PCR儀進行檢測，編號A～B，H～L使用FAM和VIC通道，編號C～G使用FAM通道。
按下列條件設置擴增反應：
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PCR循環(huán) |
熒光收集位點 |
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50℃ |
10分鐘 |
1個循環(huán) |
— |
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95℃ |
5分鐘 |
1個循環(huán) |
— |
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95℃ |
10秒 |
45個循環(huán) |
— |
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60℃ |
30秒 |
※ |
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其他儀器請參照儀器說明書進行設置。
◆ 結(jié)果判定
1. 實驗有效性判定：
（1）實驗滿足：空白對照陰性（A反應孔)；陰性對照陰性（B反應孔）；陽性對照（J反應孔）陽性；否則本次實驗無效，請與本公司技術(shù)支持聯(lián)系。
（2）過程控制（C~G反應孔）需滿足：提取效率≥1%；如提取效率＜1%，需重新檢測；但如提取效率＜1%，檢測結(jié)果為陽性，也可酌情判定為陽性。
（3）擴增控制（H~J反應孔）需滿足：抑制指數(shù)＜2.00；如抑制指數(shù)≥2.00，需比較10倍稀釋食品樣品的抑制指數(shù)；如 10 倍稀釋食品樣品擴增的抑制指數(shù)＜2.00，則擴增有效，且需采用10倍稀釋食品樣品RNA的Ct 值作為結(jié)果；10倍稀釋食品樣品擴增的抑制指數(shù)也≥2.00時，擴增可能無效，需要重新檢測；但如抑制指數(shù)≥2.00，檢測結(jié)果為陽性，也可酌情判定為陽性。
2. 結(jié)果判定
待測樣品的Ct值大于等于45時，判定為諾如病毒陰性；待測樣品的Ct值小于等于38時，判定為諾如病毒陽性；待測樣品的Ct值大于38，小于45時，應重新檢測；重新檢測結(jié)果大于等于45時，判定為諾如病毒陰性；小于等于38時，判定為諾如病毒陽性。
