熒光偏振法快速準(zhǔn)確高通量檢測(cè)IgG和含F(xiàn)c段衍生物

熒光偏振法快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)IgG和含F(xiàn)c段衍生物

Dr. Carolanne Doherty
Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland

1.     BMG多功能酶標(biāo)儀可應(yīng)用于定量IgG的新技術(shù)Valita™TITER

2.     采用熒光偏振法直接在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)IgG

3.     酶標(biāo)儀預(yù)設(shè)檢測(cè)程序和數(shù)據(jù)分析模板提高研究速度

簡(jiǎn)介

準(zhǔn)確、快速和高通量檢測(cè)IgG對(duì)于大多數(shù)治療性抗體的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是必不可少的。單克隆抗體正在生物藥物領(lǐng)域大顯身手，大量的樣本正等待著進(jìn)行篩選以進(jìn)一步得到開(kāi)發(fā)。這里我們介紹一種在細(xì)胞培養(yǎng)上清中直接定量IgG的全新的篩選技術(shù)：Valita™TITER。

現(xiàn)有的技術(shù)，包括蛋白A高效液相色譜（HPLC protein A）、ELISA技術(shù)、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相時(shí)間分辨熒光）都具有明顯的缺點(diǎn)，包括價(jià)格昂貴、耗力以及耗時(shí)。

Valita™TITER方法是一種全新的非常精確、低成本的檢測(cè)IgG的方案，檢測(cè)范圍在2.5-80mg/L。Valita™TITER采用熒光偏振技術(shù)檢測(cè)IgG的Fc段與蛋白G的結(jié)合（圖1）。分析在96孔板中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單、高通量、快速且可自動(dòng)化完成。分析可以在很少量的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行且沒(méi)有繁瑣的準(zhǔn)備過(guò)程。

在這個(gè)應(yīng)用指引中，我們介紹了在PHERAstar®，POLARstar® Omega以及CLARIOstar®多功能酶標(biāo)儀上使用Valita™TITER試劑盒定量檢測(cè)IgG的方案。

圖1：熒光偏振法定量測(cè)定IgG的Valita™TITER分析原理示意圖。96孔Valita™TITER微孔板的每個(gè)孔中預(yù)先包被了標(biāo)記了熒光的可與IgG結(jié)合的多肽-蛋白G（A）。IgG樣本結(jié)合于多肽上并通過(guò)熒光偏振和彌散（去偏振）進(jìn)行測(cè)定（B）。

圖2：分析原理：分析利用熒光偏振法進(jìn)行IgG定量。通過(guò)測(cè)定因分子旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生熒光偏振來(lái)測(cè)定樣本的濃度。小的、無(wú)結(jié)合分子在溶液中轉(zhuǎn)動(dòng)快，而大的、結(jié)合的分子轉(zhuǎn)動(dòng)慢。

熒光偏振可以有效地分析分子大小的改變�！安粍�(dòng)”的熒光基團(tuán)在偏振光的激發(fā)下會(huì)發(fā)出與激發(fā)光相同偏振方向的熒光。然而，轉(zhuǎn)動(dòng)的熒光基團(tuán)的熒光偏振方向與激發(fā)光偏振方向相比會(huì)有一定的改變。在溶液中小分子比大分子轉(zhuǎn)動(dòng)更快，因此，連接有熒光基團(tuán)的分子大小的改變，可以通過(guò)熒光去偏振程度的大小來(lái)進(jìn)行測(cè)定。所以，當(dāng)標(biāo)記有熒光的蛋白G在沒(méi)有結(jié)合其它分子時(shí)，其轉(zhuǎn)動(dòng)快，去偏振更多，而結(jié)合了IgG則相反（大5倍）（圖2）。這種偏振的改變應(yīng)用于檢測(cè)溶液中的IgG。熒光偏振（FP）通過(guò)用平行偏振方向的激發(fā)光照射溶液并在平行方向和垂直方向上測(cè)定發(fā)射熒光。FP就是這兩個(gè)偏振熒光的歸一化后的差別，通常用mP表示。

Valita™TITER分析試劑盒
Valita™TITER APP軟件（試劑盒里提供）
IgG標(biāo)準(zhǔn)品（從人血清中獲得IgG）
PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶標(biāo)儀 (BMG LABTECH)

樣品的準(zhǔn)備遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)的相應(yīng)要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用每個(gè)相對(duì)熒光值對(duì)應(yīng)一個(gè)IgG標(biāo)準(zhǔn)品的方法。在Valta™TITER微孔板的每個(gè)孔中加入60µl重建緩沖液以及60µl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。混勻后避光孵育30分鐘。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶標(biāo)儀（BMG LABTECH公司）中，采用預(yù)置的檢測(cè)程序進(jìn)行讀數(shù)（參數(shù)的設(shè)定詳見(jiàn)下表）。在MARS分析軟件中將獲得的Raw Data轉(zhuǎn)化成.csv格式文件，再用Valita™APP軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果與討論

圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有熒光偏振檢測(cè)功能的多功能酶標(biāo)儀（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita™TITER試劑盒繪制的。所有酶標(biāo)儀所獲得的結(jié)果都具備很高的穩(wěn)定性。

 

圖3：在CLARIOstar多功能酶標(biāo)儀上用Valita™TITER構(gòu)建的IgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。誤差線表示3個(gè)復(fù)孔的標(biāo)準(zhǔn)差

最后，我們用不同條件培養(yǎng)的樣品，用Valita™TITER定量IgG的結(jié)果與用常規(guī)方法HPLC的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。圖4顯示兩種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，顯示兩種定量方法都有很好的準(zhǔn)確性，而Valita™TITER分析速度更快因其不需要繁瑣的樣本準(zhǔn)備過(guò)程。

 

圖4：Valita™TITER定量IgG的結(jié)果與常規(guī)HPLC的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比

結(jié)論

在研發(fā)和生產(chǎn)此類生物藥物中對(duì)混合樣本進(jìn)行快速I(mǎi)gG濃度測(cè)定非常重要。這里我們介紹了一種基于熒光偏振法的快速、簡(jiǎn)單的進(jìn)行高通量IgG和Fc段衍生物測(cè)定全新技術(shù)——Valita™TITER分析法。Valita™TITER分析法可以直接對(duì)待測(cè)樣本中的IgG進(jìn)行定量測(cè)定而無(wú)需繁瑣的樣本準(zhǔn)備或純化過(guò)程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega應(yīng)用于Valita™TITER分析時(shí)現(xiàn)實(shí)出卓越的性能。與其它IgG的定量方便相比，Valita™TITER具有高通量、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)。

視頻：
快易達(dá)-Titer：通過(guò)BMG帶熒光偏振酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量細(xì)胞上清液中重組IgG定量的新技術(shù)

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