KinExA分子和細(xì)胞相互作用儀與SPR的技術(shù)對比

一、背景：

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國創(chuàng)立，產(chǎn)品基于獨特的Kinetic Exclusion Assay（KinExA^®）專利技術(shù)。在公司成立早期，Xavier大學(xué)、美國陸軍和環(huán)境保護(hù)局等研究單位采用KinExA技術(shù)開展了大量工作；經(jīng)過數(shù)十年在生物制藥領(lǐng)域、科研領(lǐng)域及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，KinExA技術(shù)已成為頂級制藥公司和生物技術(shù)公司以及許多大學(xué)、獨立研究實驗室和環(huán)境監(jiān)測機(jī)構(gòu)研究相互作用和生物活性物質(zhì)檢測的必備工具，并且得到FDA和EMA認(rèn)可。

二、KinExA的價值：

   新藥研發(fā)成本動輒數(shù)十上百億美元，靈敏可靠的儀器在研發(fā)早期即可協(xié)助準(zhǔn)確甄選苗頭候選藥物（hit），減少不必要的支出，降低研發(fā)風(fēng)險。由于KinExA可在生理條件下獲取準(zhǔn)確可靠的結(jié)合常數(shù)，具有很高生物相關(guān)性，而且成本極低，目前被很多頂級制藥公司用作主要的驗證工具。

三、KinExA  vs.  SPR：

1、與SPR的區(qū)別：SPR在芯片表面固定一個分子，通過芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實現(xiàn)SPR檢測。這就帶來了非常顯著的缺點：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動力學(xué)分析（例如，流速會影響實驗結(jié)果）、被檢測分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結(jié)構(gòu)其分子量有上限限制、樣品需要純化及無法檢測完整細(xì)胞。

相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會對平衡帶來影響、沒有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測未純化樣品和完整細(xì)胞；因此，極寬范圍內(nèi)的生物分子、生物結(jié)構(gòu)及完整細(xì)胞均可靈活分析

2、與SPR技術(shù)的對比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類型芯片，從Biacore系統(tǒng)獲得同一組單抗-抗原的53組數(shù)據(jù)，與KinExA實驗數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，親和力及動力學(xué)數(shù)據(jù)與所使用的芯片類型有關(guān)，帶負(fù)電荷的CM5,CM4及CM1芯片對Biacore的動力學(xué)數(shù)據(jù)有不利的影響。為了驗證這一假設(shè)，作者通過Biacore液相實驗，KinExA平衡態(tài)滴定以及KinExA動力學(xué)實驗，精確計算抗體與抗原的親和力及動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明隨著芯片表面負(fù)電荷的降低，親和力及動力學(xué)參數(shù)與液相實驗所得的結(jié)果越接近�？赡艿脑�因：（1）帶負(fù)電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結(jié)合；（2）帶負(fù)電荷的抗原與芯片表面的負(fù)電荷靜電排斥。

表中結(jié)果表明：對于Biacore技術(shù)，不同的固定方式（氨基偶聯(lián)，捕獲）以及不同的芯片，對實驗結(jié)果均有明顯影響。而采用KinExA技術(shù)，溶液中加葡聚糖，對結(jié)果也無明顯影響。

圖A,圖B均采用KinExA技術(shù)檢測。圖A中buffer不含葡聚糖，K_D=24.7pM；圖B中buffer加入葡聚糖，K_D=33.2pM。

圖C，圖D均采用Biacore技術(shù)檢測。圖C采用氨基偶聯(lián)的方式CM5芯片固定抗體，K_D=2.05nM；圖D采用捕獲的方式CM5芯片固定抗體，K_D=2.86nM

四、案例

    案例一：完整細(xì)胞的相互作用檢測

<背景>：單克隆抗體XMetA是胰島素受體（IR）變構(gòu)部分的激動劑，其激活代謝Akt激酶信號通路，而對有絲分裂胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路幾乎沒有影響。為了研究這種選擇性信號通路的性質(zhì)，作者驗證了XMetA對CHO細(xì)胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

<目的>：完整細(xì)胞親和力檢測。

<方法>：研究者將表達(dá)短鏈型（IR-A）及長鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細(xì)胞分別與XMetA孵育，通過離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測胰島素與CHO細(xì)胞表面IR-A，IR-B的親和力。

<結(jié)論>：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數(shù)據(jù)同時說明， XMetA與IR亞型的結(jié)合與胰島素?zé)o關(guān)。

     案例二：細(xì)胞與上清未純化樣品檢測

<背景>：單克隆抗體（mAb）在體內(nèi)與膜蛋白間親和力的可靠評估是腫瘤治療的主要問題。在BV展示系統(tǒng)中，膜蛋白能以天然狀態(tài)在病毒表面展示。

<目的>：細(xì)胞與上清中未純化樣品親和力檢測。

<方法>：研究者基于KinExA技術(shù)，結(jié)合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統(tǒng)，描述了一個簡單而高度敏感的單克隆抗體評估方法。

<結(jié)論>：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細(xì)胞分析方法一致（R²=0.998），表明基于KinExA技術(shù)檢測方法提供了針對細(xì)胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準(zhǔn)確的評估。

上圖中顯示的是KinExA實驗中所使用的抗原。A圖中可溶性Robo1用于標(biāo)準(zhǔn)的實驗分析；B圖中表達(dá)天然活性Robo1的CHO細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用于細(xì)胞分析實驗；C圖中表達(dá)天然活性Robo1的BV磁珠用于BV展示分析

下圖采用KinExA技術(shù)檢測抗Robo1抗體與抗原的親和力。曲線上方的數(shù)字代表抗體的活性濃度。

KinExA參考文獻(xiàn)

  Danial M, et al. 2017.Site-Specific Polymer Attachment to HR2 Peptide Fusion Inhibitors against HIV-1 Decreases Binding Association Rates and Dissociation Rates Rather Than Binding Affinity. Bioconjug Chem. 10.1021/acs.bioconjchem.6b00540.

  Fleming JK, Wojciak JM. 2017. Measuring Sphingosine-1-Phosphate: Protein Interactions with the Kinetic Exclusion Assay. Methods Mol Biol. 10.1007/7651_2017_5.

  Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

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