蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)問(wèn)題與解答

1．為什么通過(guò)elisa、WB能檢測(cè)到的蛋白在itraq實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)到？
       人血漿中的蛋白是有上萬(wàn)種的，而一般質(zhì)譜只能檢測(cè)到五六百種，也就是說(shuō)只占了其中的百分之幾，這是普遍現(xiàn)象，說(shuō)明咱們的方法是不存在問(wèn)題的；其次，ELISA/WB與質(zhì)譜相對(duì)來(lái)說(shuō)靈敏度不一樣，前者具有放大效應(yīng)，因?yàn)槠溟g會(huì)用到相應(yīng)的抗體，所以只要選對(duì)抗體，感興趣的蛋白基本都會(huì)被檢測(cè)到；因此， ELISA/WB檢測(cè)到的蛋白在組學(xué)中沒(méi)有被檢測(cè)到也是正常的。
 
2．itraq的結(jié)果，用elisa驗(yàn)證了兩個(gè)差異蛋白，發(fā)現(xiàn)都是陰性結(jié)果，是什么情況，出現(xiàn)陰性的概率有多大？一般我們會(huì)提到這個(gè)概率嗎？
       iTRAQ結(jié)果中，選擇的蛋白是否得分夠高，變化倍數(shù)大不大，選擇的抗體特異性是否好，都可能會(huì)影響WB和iTRAQ的結(jié)果，如果以上三方面沒(méi)有什么問(wèn)題的話，基本上80%還是方向一致的。
 
3．iTRAQ、TMT、Labe lfree實(shí)驗(yàn)用的是什么質(zhì)譜儀，其定量是基于一級(jí)質(zhì)譜還是二級(jí)質(zhì)譜？
       基于LC-MSMS的實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要使用的是ABI5600-Triple-TOF，同時(shí)公司也具有Thermo Q-Exactive質(zhì)譜儀平臺(tái)，部分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目使用的是QE-Exactive完成。其中標(biāo)記定量技術(shù)iTRAQ和TMT是依據(jù)二級(jí)質(zhì)譜的報(bào)告基團(tuán)離子峰進(jìn)行定量，而Labe lfree是基于一級(jí)質(zhì)譜峰進(jìn)行定量。
 
4．蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)文章一般發(fā)表在哪些期刊上，各有什么區(qū)別？
MCP（molecular & cellular proteomics（影響因子7分左右）
JPR(journal of proteome research（影響因子5分左右）
Proteomics（影響因子4分左右）
Journal of Prteomics(影響因子4分左右),
Electrophoresis(影響因子4分左右),
Plos One(影響因子3分左右),
其它的雜志還包括BMC Genomics, Expert Rev Proteomics, BMC Syst Biol, OMICS, Proteomics Clin Appl, Proteome Sci
 
5．有兩個(gè)Mix混樣，在計(jì)算差異表達(dá)蛋白時(shí)如何使用？
       計(jì)算差異表達(dá)蛋白時(shí)，將WT組（113、114、115）與Mix1（119）和Mix2（121）的比值取平均值，APO1組（116、117、118）與Mix1（119）和Mix2（121）的比值取平均值，平均值再進(jìn)行差異篩選。
 
6．生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)的區(qū)別？
       生物學(xué)重復(fù)是指不同生物個(gè)體或者不同生物群體的樣品之間進(jìn)行地相同處理而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，而技術(shù)重復(fù)是指同一樣品進(jìn)行的多次相同實(shí)驗(yàn)。舉例：對(duì)來(lái)自三只健康小鼠A、B、C的血清樣品分別各進(jìn)行一次雙向電泳，這三次雙向電泳就是生物學(xué)重復(fù)；而取其中一只小鼠的血清樣品進(jìn)行三次雙向電泳，或者將三只小鼠的血清混合后的樣品進(jìn)行三次雙向電泳，這三次實(shí)驗(yàn)就是技術(shù)重復(fù)�？偨Y(jié)生物學(xué)重復(fù)的樣品來(lái)自不同的個(gè)體或者是群體，重復(fù)之間樣品不同；而技術(shù)重復(fù)的幾次實(shí)驗(yàn)的樣品完全相同，可以來(lái)自單一個(gè)體，也可以是多個(gè)個(gè)體的混合樣品，但用于重復(fù)實(shí)驗(yàn)的樣品完全一樣。
 
7．結(jié)果報(bào)告中怎么沒(méi)有差異多肽的定量？
       多肽組質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫(kù)匹配后的結(jié)果會(huì)進(jìn)行歸一化整理并尋找差異多肽，所以說(shuō)差異多肽的定量結(jié)果是有的，且以Excel發(fā)給客戶，報(bào)告中一般會(huì)提及差異多肽的個(gè)數(shù)，具體的定量信息如果客戶有需求也是可以添加的。
 
8．哪些技術(shù)需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以及具體采用生物學(xué)重復(fù)還是技術(shù)重復(fù)來(lái)完成？
       Label free需要進(jìn)行三次重復(fù)，而iTRAQ、TMT一般建議客戶做3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，如果實(shí)驗(yàn)方案后期設(shè)計(jì)了大量的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)如WB或ELISA等，最好做也能做兩次重復(fù)；如果不進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)后期的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也少，在后期發(fā)表文章的時(shí)候結(jié)果可能會(huì)受到一些審稿人的質(zhì)疑，從而影響文章的發(fā)表，特別是一些高分雜志較為突出，對(duì)于立志于發(fā)表高水平文章的研究人員建議客戶最好進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。如果是進(jìn)行技術(shù)重復(fù)，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的數(shù)據(jù)重復(fù)性會(huì)更好，而生物學(xué)重復(fù)由于多種原因可能導(dǎo)致重復(fù)性與偏差或者不好，一般情況下Label free最好使用技術(shù)重復(fù)，這樣有利于后續(xù)數(shù)據(jù)的分析，而其他是實(shí)驗(yàn)可以采用生物學(xué)重復(fù)或者技術(shù)重復(fù)。代謝組根據(jù)樣品的不同選擇合適的數(shù)量進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)。
 
9．如何來(lái)判定哪些蛋白是和自己研究相關(guān)的蛋白，挑選什么樣的蛋白來(lái)進(jìn)行后期的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)？
       需要研究人員根據(jù)自己研究的相關(guān)生物學(xué)背景，再結(jié)合生物信息學(xué)分析的結(jié)果，以及查看相關(guān)的文獻(xiàn)資料來(lái)確認(rèn)哪些蛋白可以用于后續(xù)深入的研究。
 
10．樣品寄送過(guò)程，哪些需要低溫？哪些需要干冰？哪些常溫就可以？
       細(xì)胞、組織、蛋白溶液、菌體等樣品最好采用干冰運(yùn)輸，對(duì)于SDS-PAGE條帶和2D點(diǎn)以及酶解好的肽段樣品直接常溫運(yùn)輸即可。可以理解為需要提取蛋白或提取好的蛋白樣品（易降解）都需要低溫運(yùn)輸，而處于凝膠中的蛋白或者是酶解好的肽段可常溫運(yùn)輸。
 
11．哪些樣品需要去除高豐度蛋白？怎么去除？
（1）一般情況下，血清、血漿樣品中都會(huì)存在高豐度蛋白（白蛋白等免疫蛋白），如果客戶是此類樣品，需提前跟客戶溝通好，一定需要去除高豐度蛋白；目前有成熟的試劑盒可以去除血清中的高豐度蛋白。

（2）體液樣品，細(xì)胞培養(yǎng)液等樣品，出現(xiàn)高豐度蛋白的情況也比較高，這類樣品，如果出現(xiàn)高豐度蛋白，需要先通過(guò)質(zhì)譜鑒定是否是常見(jiàn)免疫蛋白，然后再采用高豐度蛋白去除試劑盒進(jìn)行去除。
 
（3）其他樣品存在高豐度的情況不常見(jiàn)，如在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)高豐度蛋白，解決方案如上。其他樣品可能會(huì)出現(xiàn)鑒定出來(lái)的高豐度蛋白沒(méi)有合適的試劑盒可以去除，這時(shí)候需要跟客戶提前告知風(fēng)險(xiǎn)。
 
12．蛋白質(zhì)組結(jié)果一般需要做哪些方面的生物信息學(xué)分析？
       目前一般文獻(xiàn)中的分析主要為維恩圖分析、熱圖分析、火山圖分析、層次聚類分析、蛋白質(zhì)功能分析（GO分類為主）、蛋白質(zhì)所屬代謝通路富集分析（基于KEGG的pathway）、差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)等方面。
 
       其它一些比較特異的高級(jí)分析包括多組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析、多pathway延伸分析、磷酸蛋白激酶預(yù)測(cè)分析、互作網(wǎng)絡(luò)及生物調(diào)控模型構(gòu)建分析。