【SCI 22分客戶成果】circRNA抑制由DNA感受器cGAS介導(dǎo)的長(zhǎng)期造血干細(xì)胞耗竭

      中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組主要從事腫瘤干細(xì)胞、免疫細(xì)胞發(fā)育分化及腫瘤靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與腫瘤個(gè)體化治療等領(lǐng)域的研究，近期其團(tuán)隊(duì)利用Arraystar Mouse CircRNA Array研究了小鼠骨髓細(xì)胞（BM）中分離的長(zhǎng)期造血干細(xì)胞（LT-HSCs）和多能干細(xì)胞（MPPs）的circRNAs表達(dá)譜。研究篩選出一個(gè)在LT-HSCs細(xì)胞核高表達(dá)的circRNA cia-cGAS，通過(guò)一系列功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LT-HSCs中cia-cGAS可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS相互結(jié)合并抑制了其酶活性，阻礙cGAS結(jié)合基因組DNA，從而不能激活I(lǐng)型干擾素（IFN）的表達(dá)，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)。該研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)cia-cGAS是cGAS介導(dǎo)的自身免疫相關(guān)的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發(fā)靶標(biāo)。研究成果2018年發(fā)表在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Immunity（IF=22.845）。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成提供技術(shù)服務(wù)） 

研究背景
 

       長(zhǎng)期造血干細(xì)胞作為潛能最高的干細(xì)胞系，具有最高的更新和分化能力，可以為短期造血干細(xì)胞、多能干細(xì)胞等提供了持續(xù)性細(xì)胞補(bǔ)給。大多數(shù)時(shí)候，LT-HSCs處于休眠的靜息狀態(tài)，其干性的維持受轉(zhuǎn)錄因子及骨髓內(nèi)環(huán)境等多種因素的影響，比如TNF、CXCL4和I型IFN等，然而LT-HSCs在靜息狀態(tài)與激活狀態(tài)之間的精細(xì)調(diào)控機(jī)制尚未完全解析。

       cGAS作為胞質(zhì)DNA感受器已被廣泛研究。在結(jié)合DNA時(shí)，cGAS會(huì)催化cGAMP的生成，cGAMP能結(jié)合干擾素刺激因子并誘導(dǎo)cGAS-STING信號(hào)通路的激活，從而上調(diào)I型IFN的表達(dá)和一系列免疫反應(yīng)。cGAS不僅可以識(shí)別病原性DNA，還可識(shí)別機(jī)體自身DNA。在造血干細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)的cGAS是如何避免與自身DNA結(jié)合并防止自身免疫反應(yīng)和機(jī)體損傷，仍少見(jiàn)研究報(bào)道。

       CircRNAs是一大類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮調(diào)控作用，然而關(guān)于circRNAs在LT-HSCs靜息狀態(tài)調(diào)控方面研究仍然比較少。本研究的目的就是通過(guò)circRNA芯片篩選驗(yàn)證調(diào)控LT-HSCc靜息狀態(tài)的circRNAs，并通過(guò)一系列功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究該調(diào)控的作用機(jī)制，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供新思路和潛在藥物研發(fā)靶標(biāo)。

研究思路
 

       首先作者通過(guò)Arraystar Mouse CircRNA芯片分析了小鼠骨髓中分離的LT-HSC與MPPs的circRNAs表達(dá)譜，篩選出156種差異表達(dá)的circRNAs， qPCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片一致。shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，只有D430042O09Rik基因轉(zhuǎn)錄的circRNA cia-cGAS可以影響LT-HSCc的亞群分布。隨后作者通過(guò)qPCR、Northern blot、核質(zhì)分離及原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cia-cGAS在LT-HSCs的細(xì)胞核內(nèi)高度表達(dá)。

       接下來(lái)作者對(duì)cia-cGAS的相關(guān)功能進(jìn)行了研究。作者通過(guò)刪除下游的反向互補(bǔ)序列特異性敲除cia-cGAS，F(xiàn)ACS分析表明敲除后LSK細(xì)胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，并且敲除后LT-HSCs的BrdU染色陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，表明敲除后LT-HSCs處于活躍的增殖階段。脈沖標(biāo)記也顯示敲除后LT-HSCs細(xì)胞靜息狀態(tài)的比例顯著降低。然后作者通過(guò)對(duì)敲除小鼠的mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)I型IFN表達(dá)顯著上調(diào)，qPCR和ELISA也驗(yàn)證了這一結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)表明cia-cGAS可以通過(guò)I型IFN信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控LT-HSCs的靜息狀態(tài)。

       最后作者對(duì)cia-cGAS發(fā)揮功能的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。RNA pull down、RIP、免疫熒光、EMSA和FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cia-cGAS可以和cGAS蛋白相互作用。接下來(lái)作者通過(guò)酶活測(cè)定、ChIP、HPLC、熒光素酶和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)表明cia-cGAS可以阻礙cGAS與LT-HSCs自身DNA結(jié)合，從而抑制其酶活性，不能激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)。然后作者用CRISPR/Cas9突變cGAS基因，qPCR、ELISA、BrdU標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)表明，突變后I型IFN表達(dá)被抑制，LT-HSCs細(xì)胞數(shù)量正常且更多的維持在靜息狀態(tài)。這些均表明了cia-cGAS作用的機(jī)制就是通過(guò)結(jié)合cGAS抑制其表達(dá)，從而不能激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)，維持LT-HSC的靜息狀態(tài)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在cia-cGAS敲除的小鼠中，poly（I:C）與HSV病毒的刺激均可導(dǎo)致大量I型干擾素的產(chǎn)生，從而誘發(fā)自身免疫性疾病，而cia-cGAS過(guò)表達(dá)則可以消除這些，表明cia-cGAS是cGAS介導(dǎo)的自身免疫疾病的有效抑制劑。


技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1 Arraystar mouse circRNA芯片篩選和qPCR驗(yàn)證結(jié)果及cia-cGAS表達(dá)分析結(jié)果，cia-cGAS在LT-HSCs細(xì)胞核中高表達(dá)

圖3 cia-cGAS機(jī)制研究結(jié)果，cia-cGAS結(jié)合cGAS抑制其表達(dá)，從而不能激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)，cia-cGAS是cGAS介導(dǎo)的自身免疫疾病的有效抑制劑
 

研究意義

       本研究通過(guò)Arraystar Mouse CircRNA Array篩選出一個(gè)LT-HSCs細(xì)胞核高表達(dá)的circRNA cia-cGAS，功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LT-HSCs中cia-cGAS可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS結(jié)合抑制其酶活性，阻礙cGAS結(jié)合基因組DNA，從而不能激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)。同時(shí)cia-cGAS是cGAS介導(dǎo)的自身免疫相關(guān)的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發(fā)靶標(biāo)。

原文出處
A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity，2018.