哈維氏弧菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書

哈維氏弧菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明 

動(dòng)物病害檢測系列可針對(duì)食品、動(dòng)物組織等樣品中病原的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于對(duì)哈維氏弧菌的檢測，檢出限為10³copies/μL寄生蟲基因組DNA。

• 產(chǎn)品組成（96測試）

• 適用儀器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

    ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機(jī)；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質(zhì)機(jī)、攪拌機(jī)或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

參照下述方法處理樣品。

一. 直接檢測

1. 病灶組織

(1)若對(duì)樣本不增菌直接進(jìn)行檢測，則取患病動(dòng)物的病灶組織做勻漿備用。

2. 水體

(1)取10～100mL養(yǎng)殖水，用篩網(wǎng)過濾，取濾液通過0.22um的硝酸纖維膜過濾；

(2)將濾膜剪碎振蕩重懸于500 μL 0.9% NaCl水溶液或無菌生理鹽水，12000 rpm 離心5 min，盡量棄凈上清液。

二. 增菌檢測

取待檢樣品25g（mL），加入225mL的 TYE液體培養(yǎng)基，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min均質(zhì)1 min，或者拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質(zhì)器，則將樣品放入無菌乳缽或均質(zhì)袋中磨碎，再加入10mL TYE液體培養(yǎng)基，于搖床培養(yǎng)24h。

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

• 實(shí)驗(yàn)操作

1.模板制備（樣本制備區(qū)）

請(qǐng)參照水生動(dòng)物病害基因組DNA快速提取試劑盒說明書的提取步驟。

2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進(jìn)行）

剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G、待測樣品模板、PG-VH-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

• 結(jié)果判定

檢測樣品無Ct值或≥40，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有哈維氏弧菌或含量低于檢出限；

檢測樣品Ct≤36，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽性，含有哈維氏弧菌；

檢測樣品36<Ct≤40，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值仍處于36和40之間且呈“S”型擴(kuò)增曲線，同時(shí)陰性對(duì)照無Ct值，報(bào)告樣品陽性，否則報(bào)告樣品陰性。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
•