高速Maldi成像——優(yōu)化藥物研究中的樣品分析時間
Rohan Thakur，Bruker Daltonics執(zhí)行副總裁
在過去的幾十年中，MALDI-TOF質(zhì)譜（基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間）已在大量應(yīng)用中證明了它的有效性和穩(wěn)健性，并幫助生命科學(xué)家應(yīng)對了最嚴峻的挑戰(zhàn)。諸多公司和學(xué)術(shù)機構(gòu)依靠諸如MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜系統(tǒng)等儀器來加速其研究。病理學(xué)、生物標(biāo)志物研究、藥物表征等領(lǐng)域的科學(xué)家，試圖對腫瘤異質(zhì)性進行描繪，并將這些信息與疾病結(jié)果聯(lián)系起來�；诘鞍踪|(zhì)分布的組織成像仍然是應(yīng)對這一挑戰(zhàn)的最強大的分析技術(shù)之一。
本文將重點討論新的激光技術(shù)是如何提高MALDI成像的樣本通量的。它將揭示MALDI技術(shù)作為一種成熟的技術(shù)是如何在藥物開發(fā)中應(yīng)用于化合物分布分析，以及作為一種新興工具如何提高藥物發(fā)現(xiàn)過程的效率，特別是應(yīng)用于超高通量藥物篩選中。
當(dāng)前的挑戰(zhàn)
MALDI成像是一種空間分辨、無標(biāo)記分析技術(shù)，可直接對生物樣品進行分析。而采集速度和樣品通量是質(zhì)譜成像（MSI）實驗中的限制性因素，特別是在臨床研究中。因為臨床研究需要分析大量患者的樣本，以消除個體差異。利用質(zhì)譜成像進行臨床導(dǎo)向的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究嚴重依賴于分析速度以及穩(wěn)健的操作。當(dāng)前儀器存在的局限性限制了它的充分應(yīng)用。必須突破這種局限性，才能使科學(xué)家能夠更好地從事高通量的臨床研究。
采集速度也是高空間分辨率的MSI實驗的制約因素，特別是對于較大組織切片的分析。新的MALDI成像解決方案標(biāo)志著在生產(chǎn)力、經(jīng)營成本和易用性方面的范式轉(zhuǎn)變，使質(zhì)譜成像成為個性化醫(yī)學(xué)研究的強大而可靠的信息源。
創(chuàng)新的MALDI分析技術(shù)
MALDI在制藥環(huán)境中具有廣泛的適用性。如今，這種離子化技術(shù)被用于超高通量篩選、吸收、分布、代謝和排泄（ADME）應(yīng)用中的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)，以及生物制藥的質(zhì)量控制，或被用于臨床微生物鑒定等生物/臨床診斷。以上這些應(yīng)用都對包括速度、結(jié)果分析時間、通量、易用性、明確性和穩(wěn)健性等有很高的要求。
儀器市場正在積極響應(yīng)并解決科學(xué)家關(guān)于提高樣品通量并提高數(shù)據(jù)質(zhì)量的需求，以幫助他們在最短的時間內(nèi)做出最好的決定。新的質(zhì)譜成像解決方案重新定義了MALDI成像的關(guān)鍵性能指標(biāo)，成像速度比傳統(tǒng)MALDI-TOF系統(tǒng)提升了10倍，且同時不會損失靈敏度。
化合物分布分析
雖然MALDI成像分析應(yīng)用涵蓋范圍很廣，但其共同點都是評估 分子在不同組織類型中的空間分布。MALDI成像是一種可直接從組織切片中檢測潛在的生物標(biāo)志物的分析技術(shù)，它在過去的十年中得到了普及。針對酶解產(chǎn)物空間分辨的實驗流程的優(yōu)化成為研究熱點。最重要的是，對臨床病理學(xué)中最常見的樣品類型 — 福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的病理組織，可通過原位酶切實現(xiàn)對FFPE組織中的肽的分析。此外，它還能使用肽作為替代物來對較大的蛋白質(zhì)進行檢測，并借助MS/MS來促進生物標(biāo)志物的鑒定。
傳統(tǒng)儀器的采集速度僅為2像素/秒，漫長的儀器運行時間成為制約成像實驗的瓶頸和挑戰(zhàn)。如果常規(guī)研究中樣品數(shù)目不止一個，就將很快會達到儀器運行的極限。此外，空間分辨率的提高意味著單位面積像素數(shù)目的增加以及像素直徑倒數(shù)平方值的增大。所以，無論是將科學(xué)成果進行常規(guī)化應(yīng)用，還是應(yīng)對在更高空間分辨率下減少激光光斑大小的需求，更高的采集速度都是必須的。
此外， MALDI成像具有的更高的分子特異性也是非常有益的�，F(xiàn)在正在探尋利用高分辨和MS/MS采樣模式來實現(xiàn)高的分子特異性，這要求儀器具有更快的數(shù)據(jù)采集速度，尤其是在MS/MS模式下依然保持這樣的數(shù)據(jù)采集速度。
圖1顯示了MALDI MS/MS模式下成像采集的一個實例，它顯示了在利用胰蛋白酶原位酶解組織切片后的的肽段ARTKQTAR在組織上的分布。值得注意的是，在空間分辨率為30μm的情況下，采集全部32000個像素僅花費33分鐘。采集時間只有原來的5-10之一，使整個實驗?zāi)茉谝粋�工作日內(nèi)完成。它提供了一個可用來評估并優(yōu)化原位組織酶解方案的強大工具。
圖1：H33_小鼠的肽ARTKQTAR的MS/MS質(zhì)譜成像圖（母離子m/z: 931.54 Da -> [b+18] 碎片 m/z 775.4 Da）
質(zhì)譜成像解決方案 - 數(shù)據(jù)示例
以下實例來自新一代MALDI-TOF樣機的初始數(shù)據(jù)，它能在10μm及以下像素尺寸下達到每秒50像素（圖譜）的采集速度。所示數(shù)據(jù)來自最常見的MSI應(yīng)用領(lǐng)域，包括脂質(zhì)、肽和完整蛋白質(zhì)分析。
方法
樣品制備和基質(zhì)應(yīng)用是參照以前公布的標(biāo)準(zhǔn)程序進行的。在脂質(zhì)和完整蛋白質(zhì)分析中，將10μm厚的新鮮冷凍組織切片安放在導(dǎo)電載玻片上，并用自制升華裝置將DHB基質(zhì)沉積在組織表面。對于蛋白質(zhì)，當(dāng)基質(zhì)沉積后，在恒濕試驗箱中用乙酸（5%）進行額外的再水化步驟。而在肽分析中，則將FFPE組織薄切片（4μm）安裝在載玻片上。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對樣品進行石蠟去除和抗原修復(fù)（Tris緩沖液，pH 為9）之后，使用ImagePrepTM 裝置（Bruker Daltonik GmbH，德國不來梅市）對樣品進行酶解并涂覆HCCA基質(zhì)。所有MS成像數(shù)據(jù)都是在Bruker的新一代MALDI-TOF儀器（rapifleX MALDI TissuetyperTM）的樣機上采集的。該儀器是配備新型10kHz smartbeamTM 3D激光器，具有線性/反射模式，而該激光器使用經(jīng)過優(yōu)化的激光束聚焦透鏡產(chǎn)生窄聚焦（<5μm直徑）高斯分布的激光斑點。結(jié)合一組旋轉(zhuǎn)鏡片，激光斑點可以快速精確地定位在樣品上，從而實現(xiàn)真正的方形像素。
結(jié)果
基于MALDI-TOF的組織成像的三個主要應(yīng)用領(lǐng)域的初始數(shù)據(jù)如圖所示，其主要差異在于樣品制備和所分析的m/z范圍。
·脂質(zhì)分析（約500-1,500 m/z）通常以小像素進行，以達到最高的空間分辨率（圖2）。
·完整蛋白質(zhì)分析（約2,000-20,000 m/z）。由于MALDI離子的低電荷狀態(tài)和其它類型分析器的質(zhì)量截留效應(yīng)，通常采用MALDI/TOF儀器，如rapifleX MALDI Tissuetyper（圖3）。
·（胰蛋白酶解）多肽分析（約500-4,500 m/z）是獲取FFPE組織信息的主要途徑。通常酶解步驟限制了空間分辨率（圖4）。
該平臺的性能基于以下標(biāo)準(zhǔn)：
·以高采集速度和高空間分辨率生成一致的、帶空間信息的圖像。
·在激光照射后仍能保留組織完整性，以便隨后的常規(guī)組織學(xué)檢測。
·在數(shù)據(jù)采集中和采集后，在合理的時間內(nèi)，具有對大型MSI數(shù)據(jù)集處理、分析并可視化的分析能力。
圖2：在不同的像素大�。�a-c，按比例顯示）對大鼠睪丸進行的分析。在25μm（a）時，組織結(jié)構(gòu)不能清晰地顯示，表明需要更高的分辨率。在10μm時，可見清晰形態(tài)（b）。即使在最小的像素尺寸（5μm，c-e）下，組織完整性仍被完全保留。10μm像素大小下，獲取一個大型檢測結(jié)果（0.4 cm2, 394,629像素）僅耗時137分鐘（48像素/秒），顯示了高度穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量（f）。五只小鼠腦切片（總像素594,434）測量用時約4小時（43像素/秒），導(dǎo)入常規(guī)臺式PC利用SCiLS Lab 2015b分析和可視化用時約2小時。這里展示的是分割圖（g）以及所有圖譜的主成分分析結(jié)果，顯示皮質(zhì)、海馬體和小腦組織的分離（h）。
圖3：矢狀大鼠腦切片（1.36 cm2），以30μm像素大�。�151,164像素）進行分析（a）�？偛杉瘯r間約4h（約11像素/秒）。其中四處離子的分布具有高度區(qū)域性，可以清楚地顯示出微妙的結(jié)構(gòu)，如海馬錐體細胞層（b）和室管膜（c）。樣品由Julian Langer（馬克斯·普朗克生物物理研究所，法蘭克福）提供。rapifleX MALDI Tissuetyper能在一個可行的時間范圍內(nèi)對較大的擴散性腫瘤樣本進行分析。以30μm像素大小進行的（248,825像素）人類前列腺癌（2.24 cm2）分析（d-g）�？偛杉瘯r間約8h（約8.5像素/秒）。離子分布顯示了纖維肌組織（藍）、腫瘤細胞（綠）、鰓內(nèi)粘液材料（紅）和邊緣區(qū)域（黃）。樣品由Axel Walch（亥姆霍茲慕尼黑中心）提供。
圖4：以30μm像素大�。�180,002像素）分析感染棘球絳蟲的人類肝臟組織（1.62 cm2）（a）。總采集時間約2h（約24像素/秒）。包蟲囊腫明顯與宿主組織（灰）分離。在較高放大倍數(shù)中的圖像中（b,c），囊腫的宿主（紅）和寄生蟲層（藍）清晰可見。人肺癌TMA（d）。以50μm像素大�。�51,932像素）分析了99個單獨的核。5個多肽m/z值的分布如圖所示。TMA代表了對來自大量患者的樣品進行高通量分析的一種獨特可能性。在這里，我們產(chǎn)生的數(shù)據(jù)約為1病人/分鐘。樣品由Jörg Kriegsmann（Proteopath GmbH，特里爾）提供。
腫瘤異質(zhì)性分析是腫瘤學(xué)和個性化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的生物醫(yī)學(xué)研究挑戰(zhàn)之一。MALDI成像極其適合于獲取腫瘤異質(zhì)性的無偏分子視圖。MALDI儀器可提供更高的速度和性能，使科學(xué)家有可能以足夠高的空間分辨率對大型腫瘤標(biāo)本進行分析，以獲得對腫瘤異質(zhì)性的全面理解。
提高藥物發(fā)現(xiàn)過程的效率
MALDI儀器運用的新激光技術(shù)不僅提高了MALDI成像的速度，還能應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)過程的最初階段。藥物發(fā)現(xiàn)的過程包括在某種疾病的背景下，就相關(guān)的各種酶對幾百萬純化合物進行測試。這種篩選十分耗時，因此，尋找進一步藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物的代價十分高昂。
質(zhì)譜儀器已經(jīng)用于超高通量藥物發(fā)現(xiàn)篩選。與原先的MALDI-TOF儀器相比，融合了最新技術(shù)改進的新型MALDI-TOF質(zhì)譜實現(xiàn)了更高的采集速度和穩(wěn)健性。這將2,000,000次篩選活動的耗時縮短到大約1周（取決于，例如每個樣品激光照射次數(shù)或每塊靶板可容納的樣品數(shù)量（384 vs 1536 vs 6144））。在一個實例中，在使用6144靶板進行這樣的二百萬次篩選活動之后，無需清洗透鏡組1，從而實現(xiàn)最高水平的通量連續(xù)性。
達到成像性能的新高度
質(zhì)譜成像解決方案，如rapifleX MALDI-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)，可提供高采集速度（高達每秒50個真實像素以實現(xiàn)更快更好地成像）；≤10 μm的像素大小因而實現(xiàn)最高空間分辨率以獲取生物信息；無重疊以及準(zhǔn)正方形像素，從而在高通量和高空間分辨率下提供穩(wěn)定的圖像質(zhì)量。3D激光器確保了像素到像素的再現(xiàn)性，同時作為一種全新設(shè)計的離子源，也提供了更高穩(wěn)健性。
目前先進的TOF/TOF系統(tǒng)已從基礎(chǔ)開始重新設(shè)計，以滿足當(dāng)今對深度完整和自上而下的蛋白質(zhì)表征、以及對高性能、高通量質(zhì)譜成像（MSI）的最高要求。新一代系統(tǒng)可提供更高的速度、更高的質(zhì)譜分辨率和精度，并顯著提高MS/MS質(zhì)量范圍，以實現(xiàn)新的研究和常規(guī)應(yīng)用。研究人員需要高速度和離子源的穩(wěn)健性、更寬的動態(tài)范圍、更高的特異性和分辨率，這些都有助于生物和臨床相關(guān)性脂質(zhì)、肽和蛋白質(zhì)的詳細表征。
科學(xué)家們曾期望有這樣一種系統(tǒng)，它能提供深度蛋白質(zhì)表征及對組織、細胞培養(yǎng)物或其它應(yīng)用領(lǐng)域的成像研究。而MALDI成像作為行業(yè)引領(lǐng)者，具有更好的易用性、穩(wěn)健性和穩(wěn)定性，這對于科學(xué)研究和大規(guī)模驗證都至關(guān)重要。從藥物發(fā)現(xiàn)過程的最初階段、高通量篩選（HTS），以及藥物成像——從識別潛在的候選藥物到驗證它們在組織中的分布和毒性，MALDI都大有可為。
參考文獻：
1. P. Marshall, M. Leveridge, C. Haslam, G. Clarke, J. Chandler, A. Dunn, N. Hardy, M. Pemberton, S. Dikler, J. Fuchser, Ultra High Throughput Drug Discovery Screening by MALDI-TOF Mass Spectrometry – Exceeding One Million Samples per Week, Poster W-T-223 , 第二十一屆國際質(zhì)譜大會；加拿大多倫多市；2016年8月20至26日。
Ends
作者簡介
布魯克道爾頓公司的執(zhí)行副總裁。Thakur博士擁有超過20年的質(zhì)譜經(jīng)驗，包括14年的質(zhì)譜開發(fā)經(jīng)驗并在離子光學(xué)領(lǐng)域擁有多項專利。在加入布魯克之前，他曾在Thermo公司擔(dān)任過全球營銷主管負責(zé)質(zhì)譜解決方案，還在一家醫(yī)藥研發(fā)機構(gòu)做了2年藥物研發(fā)主管。Thakur博士從堪薩斯州立大學(xué)化學(xué)系獲得博士學(xué)位，并在羅格斯大學(xué)進行博士后研究，在那里他的工作涉及到使用高分辨率質(zhì)譜分析證明開環(huán)苯代謝物——DNA和蛋白質(zhì)加合物的形成。
Email: Rohan.Thakur@bruker.com
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