【SCI 20分客戶成果】P53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN參與維護(hù)基因組的穩(wěn)定

中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬教授團(tuán)隊(duì)多年來在腫瘤細(xì)胞凋亡/生存的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子機(jī)制，非編碼RNA調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理，p53與細(xì)胞代謝及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞調(diào)控的分子機(jī)制方面做出了很多開創(chuàng)性的研究成果。近期，研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用Arraystar Human LncRNA Array對帶有WT p53表達(dá)系統(tǒng)以及沒有p53表達(dá)的H1299人肺腺癌細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究，研究篩選出了一個(gè)受p53調(diào)控的lncRNA GUARDIN，一系列功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究表明p53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN對穩(wěn)定狀態(tài)下和暴露于外源性遺傳毒性脅迫后維持基因組完整性非常重要，GUARDIN主要通過競爭性結(jié)合miR-23a調(diào)控TRF2的表達(dá)，以及作為支架分子促進(jìn)BRCA1和BARD1的結(jié)合維持BRCA1的穩(wěn)定性來發(fā)揮相應(yīng)功能。該研究表明GUARDIN可以作為癌癥治療的潛在新靶標(biāo)，相關(guān)研究成果發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Cell Biology（IF =20.06）雜志上。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

基因組穩(wěn)定性的維持是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，DNA損傷和復(fù)制應(yīng)激都將影響基因組的穩(wěn)定性。研究顯示，DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。為了應(yīng)對代謝活動(dòng)或者環(huán)境損害導(dǎo)致的DNA損傷，細(xì)胞會不間斷激活DNA損傷應(yīng)答（DDR），識別和修復(fù)DNA損傷以維持基因組穩(wěn)定性。腫瘤抑制因子p53是DDR重要的調(diào)控因子，通過細(xì)胞周期阻滯促進(jìn)DNA修復(fù)，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡消除具有嚴(yán)重DNA損傷的細(xì)胞，維護(hù)基因組的穩(wěn)定，從而抑制腫瘤的形成。p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)包含廣泛的蛋白質(zhì)編碼基因，最近的研究揭示了許多長鏈非編碼RNA（lncRNA）能參與調(diào)節(jié)對DNA損傷的p53依賴性應(yīng)答，然而關(guān)于lncRNA是如何介導(dǎo)了腫瘤抑制因子p53的DNA修復(fù)功能目前仍然不是很清楚。

本研究中作者利用Arraystar lncRNA芯片發(fā)現(xiàn)了一種p53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN對于維持基因組穩(wěn)定性是非常必要的。 GUARDIN主要是通過兩種分子作用機(jī)制來維持基因組的穩(wěn)定性：第一、作為分子海綿吸附miR-23a調(diào)控端粒重復(fù)序列結(jié)合因子（TRF2）的表達(dá)來維持染色體末端結(jié)構(gòu)的完整性；第二、作為分子支架促進(jìn)BRCA1與BARD1的結(jié)合進(jìn)而調(diào)控BRCA1的表達(dá)進(jìn)而維持細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，GUARDIN對于細(xì)胞存活和增殖也是必不可少的，因此，GUARDIN在癌癥治療中也有非常重要的研究意義。

研究思路

首先作者應(yīng)用Arraystar Human LncRNA Array對帶有WT p53表達(dá)系統(tǒng)以及沒有p53表達(dá)的H1299人肺腺癌細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究，研究篩選出了一個(gè)受p53調(diào)控的lncRNA GUARDIN。qPCR驗(yàn)證與芯片結(jié)果一致，生信分析發(fā)現(xiàn)GUARDIN有三個(gè)異構(gòu)體，其中最長的亞型在p53誘導(dǎo)時(shí)含量最豐富。接下來作者通過過表達(dá)/敲除p53、qPCR、WB、免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GUARDIN是p53響應(yīng)的lncRNA。

隨后作者對GUARDIN的功能進(jìn)行了研究，HTC116細(xì)胞中，敲除GUARDIN，細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞活力、克隆形成及異種移植物都明顯下降，表明GUARDIN是細(xì)胞存活和增殖所必需的。

最后作者對GUARDIN的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。GUARDIN主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，因此作者通過miRDB數(shù)據(jù)庫對其結(jié)合的miRNA進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)GUARDIN可以結(jié)合miR-23a，隨后通過miR-23a模擬物/抑制劑熒光素酶報(bào)告檢測及pull down等實(shí)驗(yàn)證明GUARDIN可以結(jié)合miR-23a且主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)通過敲除GUARDIN及anti-miR-23a發(fā)現(xiàn)，GUARDIN可以調(diào)控miR-23a的靶基因TRF2的表達(dá)。接下來作者通過RNA pull down結(jié)合質(zhì)譜以及RIP、WB等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GUARDIN可以和BRCA1以及BARD1相互作用，通過敲除及突變GUARDIN外顯子實(shí)驗(yàn)，證明GUARDIN可以作為分子支架介導(dǎo)BRCA1與BARD1的相互作用來調(diào)控BRCA1的表達(dá)。然后作者通過DNA損傷彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GUARDIN敲除后，DNA損傷加劇等，表明了GUARDIN對基因組穩(wěn)定性的作用，而且TRF2和BRCA1共同過表達(dá)可以消除GUARDIN下調(diào)引起的DNA損傷。上述實(shí)驗(yàn)表明GUARDIN可以通過調(diào)控TRF2和BRCA1的表達(dá)促進(jìn)基因組穩(wěn)定性。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1 芯片篩選lncRNA驗(yàn)證及GUARDIN受p53調(diào)控分析結(jié)果

圖2 GUARDIN功能研究結(jié)果，對細(xì)胞存活和增殖是必需的

圖3 GUARDIN機(jī)制研究結(jié)果，可競爭性結(jié)合 miR-487b調(diào)控TRF2表達(dá)以及介導(dǎo)BRCA1和BARD1互作調(diào)控BRCA1表達(dá)

圖4 GUARDIN機(jī)制研究結(jié)果，通過調(diào)控TRF2和BRCA1維持基因組穩(wěn)定性

研究意義

在這項(xiàng)研究中，研究人員通過Arraystar lncRNA芯片篩選出了p53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN，通過一系列功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明GUARDIN競爭結(jié)合mi-23a促進(jìn)TRF2表達(dá)，維持染色體末端結(jié)構(gòu)的完整性，GUARDIN促進(jìn)BRCA1與BARD1的結(jié)合而穩(wěn)定BRCA1，維持細(xì)胞的DNA修復(fù)能力。GUARDIN對細(xì)胞存活和增殖也是必需的，具有潛在的抑癌效應(yīng)，可能成為癌癥臨床藥物治療的潛在靶標(biāo)。

原文出處

GUARDIN is a p53-responsive long non-coding RNA that is essential for genomic stability. Nature Cell Biology, 2018