蝦源性成分核酸檢測(cè)試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書

蝦源性成分核酸檢測(cè)試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書

◆ 產(chǎn)品說明

 物種鑒定系列中的過敏原鑒定試劑，可針對(duì)食品中過敏原成分的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于食品及其原料中過敏原蝦成分的檢測(cè)，可于一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)蝦與北極蝦，檢出限為0.01%。（需注意：FAM通道的檢測(cè)引物為蝦的檢測(cè)引物，對(duì)海蟹、蝦/蟹爬、虎頭蟹、赤甲蟹有非特異性擴(kuò)增。VIC通道的為北極蝦的檢測(cè)引物。）

◆ 產(chǎn)品組成（96測(cè)試）

021132LⅡ
試劑	含量
A-蝦源-P	20μL × 8管× 12排
NG-P	100μL × 3支
PG-蝦源-P	100μL × 2支

• 適用儀器

    ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實(shí)時(shí)熒光PCR儀。（可同時(shí)檢測(cè)FAM通道（494 nm）、VIC通道（538nm）兩種通道的熒光定量PCR儀）。

◆ 自備耗材和儀器

 ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機(jī)；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆樣品處理

參照《SN/T 1961.10-2013 出口食品過敏原成分檢測(cè) 第10部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)蝦/蟹成分》或其他標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，制備的樣本保存待用。

樣品的采集和制備是過敏原成分鑒別的重要步驟，防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的規(guī)定執(zhí)行。

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

1.模板制備（樣本制備區(qū)）

  建議使用配套動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。

2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進(jìn)行）

  剪下所需測(cè)試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G、待測(cè)樣品模板、PG-蝦源-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3.擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   使用熒光定量PCR儀，使用FAM和VIC通道。

   按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

PCR循環(huán)			熒光收集位點(diǎn)
95℃	30秒	1個(gè)循環(huán)	—
95℃	15秒	45個(gè)循環(huán)	—
60℃	40秒		※

4.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)。

◆結(jié)果判定

同時(shí)進(jìn)行的陰性、陽性、空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，檢測(cè)樣品FAM與VIC通道均無熒光增幅現(xiàn)象，判斷樣品中未檢出致敏原蝦成分。

同時(shí)進(jìn)行的陰性、陽性、空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，檢測(cè)樣品有明顯的熒光增幅曲線，且Ct值≤35，判斷樣品中檢出致敏原蝦成分。

同時(shí)進(jìn)行的陰性、陽性、空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，若檢測(cè)樣品熒光增幅曲線的Ct值在35-40之間，則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍在35-40之間，可判斷樣品中檢出致敏原蝦成分，否則可判斷樣品中未檢出過敏原蝦成分。

FAM與VIC通道其中有一個(gè)檢測(cè)結(jié)果為陽性，即可判斷該樣品中檢出致敏原蝦成分。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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