Cre-loxP重組系統(tǒng)技術(shù)詳解

Cre-loxP重組系統(tǒng)

一．Cre-loxP重組系統(tǒng)作用原理

1. Cre重組酶和loxP位點(diǎn)

Cre重組酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，是由343個(gè)氨基酸組成的38kD的蛋白質(zhì)。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能夠特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)。

LoxP（locus of X-overP1）位點(diǎn)長(zhǎng)為34bp，包括兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的間隔區(qū)域。其中，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)，而間隔區(qū)域決定了loxP位點(diǎn)的方向。

 

 

 

      圖1. Cre重組酶和loxP位點(diǎn)

（http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design）

 

2. Cre-loxP重組系統(tǒng)誘導(dǎo)基因重組的方式

      

 Cre-loxP系統(tǒng)存在幾種誘導(dǎo)重組的方式，這是基于Cre重組酶與loxP位點(diǎn)的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。

        當(dāng)基因組內(nèi)存在loxP位點(diǎn)時(shí)，一旦有Cre重組酶，便會(huì)結(jié)合到loxP位點(diǎn)兩端的反向重復(fù)序列區(qū)形成二聚體。此二聚體與其他loxP位點(diǎn)的二聚體結(jié)合，進(jìn)而形成四聚體。隨后，loxP位點(diǎn)之間的DNA被Cre重組酶切下，切口在DNA連接酶的作用下重新連接。重組的結(jié)果取決于loxP位點(diǎn)的位置和方向。主要存在幾下幾種重組方式：

（1） 兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶敲除loxP間的序列；

（2） 兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相反，Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列翻轉(zhuǎn)；

（3） 兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶誘導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位；

（4） 四個(gè)loxP位點(diǎn)分別位于兩條DNA鏈或染色體上，Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列互換。

 

 

圖2. Cre-loxP誘導(dǎo)基因重組的方式

（https:///search/rolling%20circle%20replication）

 

二．Cre-loxP重組系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

   

 

之所以Cre-loxP重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面得到廣泛的應(yīng)用，因其具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。主要體現(xiàn)在：時(shí)空特異、高效性、準(zhǔn)確性、快速性。

 

 

圖3. Cre-loxP重組系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

 

三．Cre-loxP重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

   

    

 

由于Cre-loxP重組系統(tǒng)的高效簡(jiǎn)單的作用方式，它已在基因定點(diǎn)刪除、外源基因定點(diǎn)整合、疾病動(dòng)物模型建立、篩選高效表達(dá)基因座等方面得到了有效利用，成為體內(nèi)外DNA重組的有力工具。

 

圖4. Cre-loxP重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

 

四．病毒依賴的基因重組的優(yōu)勢(shì)

 

      應(yīng)用Cre-loxP重組系統(tǒng)較為常見(jiàn)的形式是兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的雜交。一般的策略為：

      （1） 利用原核注射的方法獲得轉(zhuǎn)基因“Cre小鼠”。一般利用特定啟動(dòng)子控制此小鼠的Cre重組酶的表達(dá)；

      （2） 通過(guò)置換型載體的同源重組，在胚胎干細(xì)胞中向靶位點(diǎn)引入選擇標(biāo)記基因，并在其兩側(cè)引入兩個(gè)loxP位點(diǎn)，要求兩條同源染色體都帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)，且不能干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄。將此胚胎干細(xì)胞注入假孕母鼠中，發(fā)育成“floxed小鼠”；

      （3） “Cre小鼠”與“floxed小鼠”交配，產(chǎn)生的后代體內(nèi)，Cre重組酶會(huì)與loxP位點(diǎn)發(fā)生作用，導(dǎo)致基因重組。

 

      雖然此法具備了Cre-loxP重組系統(tǒng)的高效、特異的重組，但存在許多不足：

 

 

 

      目前，由于病毒依賴的基因重組能否克服轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物的諸多不足，從而成為越來(lái)越多科研工作者的新選擇。病毒依賴的Cre-loxP重組系統(tǒng)的策略為：

      （1） 通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物辦法獲得一只“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；

      （2） 病毒注射此“Cre小鼠”或“floxed小鼠”，引入loxP或Cre重組酶元件。

      此方法優(yōu)勢(shì)明顯：

 

五．維真為您提供Cre-loxP重組系統(tǒng)的AAV載體構(gòu)建和病毒包裝服務(wù)

 

 

1. 依賴Cre重組酶誘導(dǎo)表達(dá)的FLEX-ON系統(tǒng)

 

     

結(jié)合組織特異性的啟動(dòng)子和不同的AAV血清型，維真提供的FLEX-ON系統(tǒng)能幫您獲得更精準(zhǔn)的組織特異性控制和時(shí)間控制。

        在FLEX-ON系統(tǒng)中，目的基因反方向位于啟動(dòng)子下方，兩側(cè)分別連接兩個(gè)“頭對(duì)頭”的loxP。Cre重組酶不存在時(shí)，目的基因不能表達(dá)；當(dāng)Cre重組酶存在時(shí)，可以誘導(dǎo)目的基因的“翻轉(zhuǎn)”，從而表達(dá)。

 

 

圖5.維真提供依賴Cre的FLEX-ON系統(tǒng)示意圖（上）維真的FLEX-ON實(shí)驗(yàn)圖（下）

 

2. 依賴Cre重組酶反式剪接系統(tǒng)——輕松擁有“表達(dá)大基因的AAV”

較小的包裝能力（小于5kb）使得AAV應(yīng)用受到限制。維真為您提供依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)，讓您輕松擁有“表達(dá)大基因的AAV”。

多個(gè)重組AAV的共轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%，維真將較大基因分為兩部分構(gòu)建于兩個(gè)AAV載體上。通過(guò)ITR的重組、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。相比于單個(gè)載體維真提供的依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)的表達(dá)效率約20%。

 

圖7. 維真提供依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)示意圖（左）維真的依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)圖（右）