沙門氏菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書
沙門氏菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產品說明
致病菌檢測系列可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結果。本產品用于沙門氏菌的檢測。檢出限為103 CFU/ml。
◆ 產品組成（96測試）
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011012LⅡ |
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試劑 |
含量 |
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A-Sal-P |
20μL × 8管× 12排 |
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NG-P |
100μl× 3支 |
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PG-Sal-P |
100μl× 2支 |
◆ 適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬�。虎蘧|機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。
2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。
3）第三區(qū)：擴增及產物分析區(qū)。
★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
參照《GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》中的5.1或其他標準處理樣品，對樣品進行前增菌，制備的菌液保存待用。
稱取 25 g（ml）樣品放入盛有225 mL BPW 的無菌均質杯中，以8000 rpm/min～10000 rpm/min均質1 min～2 min，或置于盛有225ml BPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打 1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，不需要均質，振蕩混勻。如需測定 pH 值，用1 mol/ml無菌 NaOH 或 HCl 調 pH 至 6.8 ± 0.2。無菌操作將樣品轉至 500 ml錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養(yǎng)，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 8 h～18 h。
如為冷凍產品，應在45 ℃以下不超過15 min，或2 ℃～5 ℃不超過18 h解凍。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
1. 模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用試劑配套細菌組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。
2．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-Sal-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
3. 擴增反應（擴增及產物分析區(qū)）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
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PCR循環(huán) |
熒光收集位點 |
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95℃ |
3分鐘 |
1個循環(huán) |
— |
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94℃ |
5秒 |
40個循環(huán) |
— |
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60℃ |
40秒 |
※ |
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4.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環(huán)的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點。
◆ 結果判定
檢測樣品Ct≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有沙門氏菌或含量低于檢測限；
檢測樣品Ct≤35.0，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有沙門氏菌；
檢測樣品35.0＜Ct＜40.0，需進行一次重復實驗，若Ct值≥40.0則為陰性，否則為陽性。
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線且Ct值＜30，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
