諾如病毒GI型、GII型RNA核酸檢測試劑盒（帶IAC，PCR-雙色熒光法）使用說明書
諾如病毒GI型、GII型RNA核酸檢測試劑盒（帶IAC，PCR-雙色熒光法）
◆ 產(chǎn)品說明
諾如病毒GI型、GII型RNA核酸檢測試劑盒（PCR-雙色熒光法）參照GB 4789.42-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》進(jìn)行設(shè)計(jì)，可于一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測GI型、GII型諾如病毒；適用于貝類生，食蔬菜，胡蘿卜、瓜、堅(jiān)果等硬質(zhì)表面食品，草莓、西紅柿、葡萄等軟質(zhì)水果等食品中GI型、GII型諾如病毒核酸的檢測。
◆ 產(chǎn)品組成（96測試）
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012132L | |
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試劑 |
含量 |
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A-GIGII |
1200μL× 1支 |
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IAC-Nor |
860μL× 1支 |
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B-Nor |
500μL × 2支 |
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PG-Nor |
100μL × 2支 |
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NG-Nor |
100μL × 2支 |
◆ 適用儀器
ABI 系列、MJ 系列、Roche 系列、博日系列以及其它熒光定量PCR 檢測儀（可同時(shí)檢測FAM通道（494 nm）、VIC通道（538nm）兩種通道的熒光定量PCR儀）。
◆ 自備耗材和儀器
①1.5mL或2.0mL離心管（RNase free）；②0.1mL或0.2mL PCR管或八聯(lián)管（RNase free）；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭（RNase free）；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴。
◆ 注意事項(xiàng)
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。
2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。
3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。
★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。
3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。
5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
◆ 試劑盒組分及樣品處理說明
（1）樣品前處理請參照GB 4789.42-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》進(jìn)行樣品前處理。
（2）A-GIGII為GI、GII反應(yīng)液，含有諾如病毒GIGII型引物探針。
（3）IAC-Nor為過程控制反應(yīng)液，含有過程控制病毒引物探針。
（4）B-Nor為提取過程控制液，進(jìn)行樣品RNA提取時(shí)請參照國標(biāo)法加入10 μL B-Nor作為提取過程控制；亦可參照國標(biāo)法另取50-100 μL B-Nor，用PBS緩沖液補(bǔ)足至200 μL，進(jìn)行核算提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及計(jì)算提取效率。
（5）NG-Nor為陰性對照，也可參照國標(biāo)法提取陰性樣品核酸作為陰性對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（6）PG-Nor含GI型、GII型諾如病毒核酸，可作為陽性對照，亦可參照國標(biāo)法作為擴(kuò)增控制計(jì)算抑制指數(shù)。
*推薦使用病毒RNA提取試劑盒中的方案進(jìn)行病毒RNA的提取，或者采用其他等效產(chǎn)品進(jìn)行RNA提取。
◆ 實(shí)驗(yàn)操作（推薦）
1. 反應(yīng)體系配制：（樣本制備區(qū)）
參照下表，計(jì)算反應(yīng)液用量，渦旋混勻，離心30s，分裝于0.1mL或0.2mLPCR管中，進(jìn)行模板加入。
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孔編號 |
實(shí)驗(yàn)意義 |
反應(yīng)液 |
加入模板 |
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A |
空白對照 |
A-GIGII |
5μL RNase free water |
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B |
陰性對照 |
A-GIGII |
5μL陰性對照 |
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C |
病毒提取過程控制1 |
IAC-Nor |
5μL樣品RNA |
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D |
病毒提取過程控制2 |
IAC-Nor |
5μL過程控制病毒RNA |
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E |
病毒提取過程控制3 |
IAC-Nor |
5μL 101倍稀釋過程控制病毒RNA |
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F |
病毒提取過程控制4 |
IAC-Nor |
5μL 102倍稀釋過程控制病毒RNA |
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G |
病毒提取過程控制5 |
IAC-Nor |
5μL 103倍稀釋過程控制病毒RNA |
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H |
擴(kuò)增控制1 |
A-GIGII |
5μL樣品RNA+1μL擴(kuò)增控制RNA |
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I |
擴(kuò)增控制2 |
A-GIGII |
5μL 10倍稀釋樣品RNA+1μL擴(kuò)增控制RNA |
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J |
擴(kuò)增控制3 |
A-GIGII |
5μL RNase free water+1μL擴(kuò)增控制RNA |
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K |
樣品1 |
A-GIGII |
5μL樣品RNA |
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L |
樣品2 |
A-GIGII |
5μL 10倍稀釋樣品RNA |
配制完成后請蓋上PCR管蓋，渦旋混勻并離心后上機(jī)反應(yīng)。
*請參照上表對管進(jìn)行編號，以免混淆。
2. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）
使用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，編號A～B，H～L使用FAM和VIC通道，編號C～G使用FAM通道。
按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：
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PCR循環(huán) |
熒光收集位點(diǎn) | ||
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50℃ |
10分鐘 |
1個(gè)循環(huán) |
— |
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95℃ |
5分鐘 |
1個(gè)循環(huán) |
— |
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95℃ |
10秒 |
45個(gè)循環(huán) |
— |
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60℃ |
30秒 |
※ | |
其他儀器請參照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置。
◆ 結(jié)果判定
1. 實(shí)驗(yàn)有效性判定：
（1）實(shí)驗(yàn)滿足：空白對照陰性（A反應(yīng)孔)；陰性對照陰性（B反應(yīng)孔）；陽性對照（J反應(yīng)孔）陽性；否則本次實(shí)驗(yàn)無效，請與本公司技術(shù)支持聯(lián)系。
（2）過程控制（C~G反應(yīng)孔）需滿足：提取效率≥1%；如提取效率＜1%，需重新檢測；但如提取效率＜1%，檢測結(jié)果為陽性，也可酌情判定為陽性。
（3）擴(kuò)增控制（H~J反應(yīng)孔）需滿足：抑制指數(shù)＜2.00；如抑制指數(shù)≥2.00，需比較10倍稀釋食品樣品的抑制指數(shù)；如 10 倍稀釋食品樣品擴(kuò)增的抑制指數(shù)＜2.00，則擴(kuò)增有效，且需采用10倍稀釋食品樣品RNA的Ct 值作為結(jié)果；10倍稀釋食品樣品擴(kuò)增的抑制指數(shù)也≥2.00時(shí)，擴(kuò)增可能無效，需要重新檢測；但如抑制指數(shù)≥2.00，檢測結(jié)果為陽性，也可酌情判定為陽性。
2. 結(jié)果判定
待測樣品的Ct值大于等于45時(shí)，判定為諾如病毒陰性；待測樣品的Ct值小于等于38時(shí)，判定為諾如病毒陽性；待測樣品的Ct值大于38，小于45時(shí)，應(yīng)重新檢測；重新檢測結(jié)果大于等于45時(shí)，判定為諾如病毒陰性；小于等于38時(shí)，判定為諾如病毒陽性。
