細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中IgG檢測(cè)流程的簡(jiǎn)化

簡(jiǎn)介

在不同的研究人員中，以抗體為基礎(chǔ)的治療藥物的細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程可能有很大不同。最終目標(biāo)是找到可以穩(wěn)定產(chǎn)生大量單克隆抗體的細(xì)胞克隆。IgG 產(chǎn)物檢測(cè)在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)單克隆抗體的多個(gè)階段都是非常重要的一步 ( 圖 1 )。通常 IgG 定量的方法都需要專門的儀器和技術(shù)人員，例如 HPLC 和表面干涉測(cè)量，或是要花費(fèi)大量時(shí)間的 ELISA 檢測(cè) ( 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) )。盡管 ELISA 是蛋白定量的成熟方法，但它也是一種冗長(zhǎng)的、多個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)過(guò)程 ( 表 1 )。這里，我們向大家介紹使用 Valitacell 公司Valita®TITER實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗體開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中 IgG 的方法。

ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)使用簡(jiǎn)單“add-and-read”( 添加和讀數(shù) ) 方式測(cè)定 2.5 ‒ 100 mg/L 濃度的 IgG。此實(shí)驗(yàn)過(guò)程不到 1 小時(shí)即可完成且能夠整合到以 96 孔板為規(guī)格的生物反應(yīng)工作流程中。此實(shí)驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)高通量和全自動(dòng)。其過(guò)程可在細(xì)胞培養(yǎng)基中用少量樣品進(jìn)行，沒(méi)有復(fù)雜的準(zhǔn)備步驟。

可用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的 Molecular Devices 公司多功能微孔讀板機(jī)有：SpectraMax®iD5多功能微孔讀板機(jī)、帶熒光偏振檢測(cè)卡盒的 SpectraMax® i3x 多功能微孔讀板機(jī)和 SpectraMax® M5 多功能微孔讀板機(jī)。

圖 1 從細(xì)胞轉(zhuǎn)染到擴(kuò)大生產(chǎn)的細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程

優(yōu)點(diǎn)

• 輕松采集數(shù)據(jù)并利用 SoftMax Pro軟件的預(yù)設(shè)模板分析數(shù)據(jù)
• 快速、均相實(shí)驗(yàn)，不超過(guò) 1 小時(shí)即可獲得結(jié)果
• 2.5-100 mg/L IgG 濃度范圍的精確測(cè)定

表 1 比較 ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)與其他方法在 IgG 定量檢測(cè)方面的性能表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)原理

ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)基于對(duì) IgG Fc 片段與蛋白 G 的相互作用采用熒光偏振 ( FP )技術(shù)檢測(cè)。96 孔微滴度板的每個(gè)孔中都包被有熒光標(biāo)記的 IgG 結(jié)合多肽，蛋白 G。當(dāng)加入樣品到孔板中時(shí)，蛋白G 分子被重懸并發(fā)生結(jié)合。一旦結(jié)合抗體，蛋白 G 分子的運(yùn)動(dòng)速率便會(huì)下降，導(dǎo)致熒光偏振 ( FP ) 值的增加 ( 圖 2)。

圖 2 ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)原理使用 FP 技術(shù)檢測(cè)。自由的蛋白 G 分子很小且在緩沖液中快速旋轉(zhuǎn)。結(jié)果是偏振激發(fā)光丟失了偏振性 ( 上圖 )。當(dāng)?shù)鞍?G 分子在樣品中結(jié)合了抗體，較大的復(fù)合體旋轉(zhuǎn)就會(huì)減慢導(dǎo)致 FP 值的增加 ( 下圖 )

材料

• ValitaTITER 檢測(cè)試劑盒(Valitacell cat. #00010)
• IgG 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma cat. #I2511)
• CD CHO 培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific cat. #10743011)
• 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的樣品：懸液培養(yǎng)產(chǎn)生CHO 細(xì)胞系的重組 IgG 培養(yǎng)上清液
• 安裝有 535-nm FP 發(fā)射濾片的SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機(jī)
• 帶有熒光偏振 ( FP-FLUO ) 檢測(cè)卡盒的 SpectraMax i3x 多功能微孔讀板機(jī)
• SpectraMax M5 多功能微孔讀板機(jī)

方法

IgG 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋到 CD CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中使?jié)舛仍?2.5 和 100 mg/L 之間。細(xì)胞培養(yǎng)上清中的一系列 IgG 樣品按需要稀釋到細(xì)胞培養(yǎng)基中。加入 60 µLValitaMab 重組緩沖液到 ValitaTITER板的每個(gè)孔中，然后再迅速加入 60 µL準(zhǔn)備好的細(xì)胞樣品或蛋白標(biāo)準(zhǔn)品�；靹驑悠坊驑�(biāo)準(zhǔn)品并在室溫下避光孵育30 分鐘。在 SpectraMax iD5 讀板機(jī)上 使 用 內(nèi) 置 的 光 柵 光 路 激 發(fā) 并 用535-nm 發(fā)射濾片檢測(cè)FP 信號(hào)。使用SoftMax Pro 軟件中的預(yù)設(shè)模板獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析 ( 圖 3 )。同樣在Spectra-Max i3x 和 SpectraMax M5 讀板機(jī)上檢測(cè) FP 以驗(yàn)證它們的性能表現(xiàn) ( 數(shù)據(jù)未示 )。

用蛋白 A 的 HPLC 數(shù)據(jù)對(duì)比。根據(jù)生產(chǎn)廠家操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖 3 ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)流程。(A) ValitaMab 重組緩沖液加入到 ValitaTITER 板的每個(gè)孔中。(B) 樣品或 IgG 標(biāo)準(zhǔn)品加入到孔中。(C) 孔板孵育 30 分鐘為結(jié)合的發(fā)生。(D) 使用 SoftMax Pro 軟件在SpectraMax iD5 讀板機(jī)上檢測(cè) FP

結(jié)果

ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)利用簡(jiǎn)單的“add-and-read”( 添加和讀數(shù) ) 方式獲得 IgG 標(biāo)準(zhǔn)曲線，中間無(wú)洗滌步驟且只需少量樣品 ( 5-30 µL )。在 SpectraMax iD5讀板機(jī)上使用內(nèi)置的光柵激發(fā)光路和535-nm FP 射濾片可獲得最佳結(jié)果。濃度從 3.1 到 100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品所檢測(cè)到的結(jié)果在整個(gè)濃度范圍內(nèi)均保持了高度線性 (r 2 = 0.998) ( 圖 4 )。Spectra-Max i3x 和 SpectraMax M5 讀板機(jī)也獲得了相似的數(shù)據(jù) ( 數(shù)據(jù)未展示 )。SoftMax Pro 軟件中的預(yù)設(shè)模板可自動(dòng)計(jì)算出 mP 結(jié)果并繪制曲線圖。對(duì)進(jìn)料間歇反應(yīng)器條件培養(yǎng)基樣品的ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 HPLC 進(jìn)行了
比較。兩種方法呈現(xiàn)出高度的一致性，r 2 = 0.994 ( 圖 5 )。

圖 4 使用 ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)在 SpectraMax iD5 讀板機(jī)上生成 IgG 標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)采用SoftMax Pro 軟件中的線性擬合繪制曲線圖 (r 2 = 0.998)。誤差線表示 6 個(gè)重復(fù)標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖 5 ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)的 IgG 定量結(jié)果和蛋白 A 的 HPLC 分析結(jié)果進(jìn)行比較。進(jìn)料間歇生物反應(yīng)器中一系列條件培養(yǎng)基的 IgG 滴度通過(guò) ValitaTITER 熒光偏振實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定量。這些樣品同樣也通過(guò)蛋白 A 的 HPLC 進(jìn)行分析

總結(jié)

IgG 定量必須在細(xì)胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程的多個(gè)步驟中進(jìn)行以保證最終擴(kuò)大化生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量，因此一種以盡可能少的時(shí)間獲得最準(zhǔn)確結(jié)果的測(cè)定方法對(duì)成功至關(guān)重要。這里我們展示了由 ValitaTITER實(shí)驗(yàn)得到的IgG 定量數(shù)據(jù)與 HPLC 的分析結(jié)果高度匹配，后者被廣泛認(rèn)為是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，然而前者所需的時(shí)間還不到 HPLC 的 3% 。ValitaTITER 實(shí)驗(yàn)是一種均相的、高通量的方法，可在細(xì)胞系開(kāi)發(fā)工作流程中精確快速的檢測(cè) IgG 含量。這種實(shí)驗(yàn)的96 孔板檢測(cè)已在 SpectraMax iD5 讀板機(jī)和其他具有 FP 功能的 MolecularDevices 公司讀板機(jī)上被充分驗(yàn)證通過(guò)，保證結(jié)果的可靠性。而 SoftMax Pro 軟件則大大減少檢測(cè)參數(shù)的設(shè)置時(shí)間并自動(dòng)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算樣品濃度。