新離子化基板應(yīng)用：解決MALDI質(zhì)譜成像前處理困難

基質(zhì)輔助激光解吸電離法（MALDI：Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization）是將能吸收激光能量的低分子有機(jī)化合物（下稱Matrix）與待測(cè)樣品混合，通過(guò)激光照射，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行離子化的方法。在質(zhì)量分析的同時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的成分、分布狀態(tài)進(jìn)行圖像化的質(zhì)譜成像。這種方法自上世界80年代末問(wèn)世以來(lái)，就將質(zhì)譜應(yīng)用提升了一個(gè)新臺(tái)階，并成為了目前生物質(zhì)譜領(lǐng)域研究必不可少的工具。

不過(guò)想利用MALDI法進(jìn)行質(zhì)譜成像，要先通過(guò)一套前處理操作的考驗(yàn)。也就是Matrix的調(diào)和、涂布、干燥的工序。而這對(duì)于沒(méi)有受過(guò)太多專業(yè)訓(xùn)練的質(zhì)譜用戶來(lái)說(shuō)并不容易。

名古屋大學(xué)多變生物分子研究所（Institute of Transformative Bio-Molecules, ITbM）的桑田啓子女士所在的團(tuán)隊(duì)就遇到了這個(gè)難題。不過(guò)濱松新型離子化基板DIUTHAME（Desorption Ionization Using ThroughHole Alumina Membrane，是的，它的名字hin長(zhǎng)̷叫它“丟森”好了）的面世，讓事情有了變化。

將待測(cè)樣品加載到DIUTHAME上，利用毛細(xì)血管現(xiàn)象（在細(xì)管內(nèi)側(cè)，液體從管子中上升的現(xiàn)象），使待測(cè)樣品的分子上升到表面，通過(guò)激光照射使其離子化而不破壞分子結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)在不使用Matrix的情況下，進(jìn)行質(zhì)譜成像分析。

從最開(kāi)始“試試看”的心態(tài)，到最后“果然還是DIUTHAME方便”的感嘆，她和它的團(tuán)隊(duì)經(jīng)歷了什么呢？讓我們來(lái)一起看看吧！

名古屋大學(xué)多變生物分子研究所特任助教

桑田啓子女士

問(wèn)：您主要從事什么樣的研究工作？

我在ITbM研究所分子構(gòu)造中心任主管一職。對(duì)化學(xué)、生物學(xué)有著巨大影響的“多變生物分子”是ITbM的整體研究目標(biāo)，當(dāng)然也是我們中心每日研究的對(duì)象。

分子構(gòu)造中心管理維護(hù)著以最尖端的質(zhì)譜儀為代表的許多大型分析設(shè)備。而這些設(shè)備也是對(duì)外部機(jī)構(gòu)開(kāi)放的，以便與他方共同展開(kāi)以蛋白質(zhì)組學(xué)為中心的研究。我們一年間收到的測(cè)定和解析的委托（包含前處理）在300件以上，樣品數(shù)超過(guò)2000件。對(duì)于這些委托，我們都希望以高成功率得出測(cè)定結(jié)果，反饋給各機(jī)構(gòu)。

在開(kāi)展這樣共同研究的同時(shí)，我們也積極與企業(yè)合作，一起進(jìn)行產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，探索設(shè)備改良的辦法，以推動(dòng)最后研究成果的達(dá)成。

問(wèn)：分子構(gòu)造中心的設(shè)備是否只用于特定領(lǐng)域或者特定的樣品檢測(cè)？

我們將設(shè)備的有效利用擺在第一位，并沒(méi)有特定的限制。而中心也收到了許多國(guó)內(nèi)外的動(dòng)植物樣本。

本次雖然最終是將DIUTHAME應(yīng)用在了老鼠大腦的測(cè)定中，但在收到這個(gè)樣本之前，也對(duì)較容易獲得的黑米等食品樣品進(jìn)行了測(cè)定。而今后，我們也想將DIUTHAME應(yīng)用在植物研究相關(guān)的領(lǐng)域。

 

制成切片樣本前的老鼠腦的凍結(jié)切片

問(wèn)：目前DIUTHAME會(huì)較多應(yīng)用在老鼠大腦樣品的測(cè)定中，是否可以談?wù)勗趧?dòng)物組織的測(cè)定中應(yīng)用DIUTHAME的感受？

動(dòng)物的組織切片和DIUTHAME簡(jiǎn)直是最佳組合。我認(rèn)為這是到目前為止，處理過(guò)的樣本中最佳的組合方式。

質(zhì)譜成像分析中，多數(shù)人都認(rèn)為必須通過(guò)有機(jī)溶劑來(lái)提取化合物，而使用DIUTHAME的話，就不需要了。只要材料的組織切片是有液體的，將待測(cè)樣品加載到DIUTHAME上，就可以憑借毛細(xì)血管現(xiàn)象，使待測(cè)樣品的分子上升到表面。此外，DIUTHAME不需涂布Matrix，因而也不存在由結(jié)晶的尺寸決定分辨率的問(wèn)題，可獲得更高的空間分辨率。由于沒(méi)有復(fù)雜的工序，這樣的方法還具有重現(xiàn)性良好的優(yōu)點(diǎn)。

問(wèn)：在了解DIUTHAME之前，有進(jìn)行過(guò)質(zhì)譜成像分析嗎？

有嘗試過(guò)，但技術(shù)門檻較高，對(duì)于非專業(yè)人員來(lái)講難度較大。2013年曾借用過(guò)一周的噴霧設(shè)備，嘗試檢測(cè)鵪鶉頭后部極微量存在的荷爾蒙，可能因?yàn)榍疤幚聿划?dāng)或荷爾蒙量過(guò)少，未能成功。

后來(lái)隨著中心成員的增加，“質(zhì)譜成像分析”再次被提了出來(lái)。因?yàn)橐呀?jīng)體會(huì)到了涂布Matrix的操作比較困難，所以這次選擇了從“LDI（激光電離解析）方法能檢測(cè)的樣品”著手。雖然通過(guò)LDI法可檢測(cè)的化合物有很多，但易產(chǎn)生碎片，是一種硬電離法，所以很多化合物也無(wú)法通過(guò)它進(jìn)行檢測(cè)。最后，還是只有回歸依靠Matrix的辦法。正在困擾之際，DIUTHAME就登場(chǎng)了。

問(wèn)：您是什么時(shí)候了解到DIUTHAME的？

2016年11月，我們?cè)跒I松公司豐岡制造所舉辦的質(zhì)譜分析學(xué)會(huì)上了解到了DIUTHAME，當(dāng)時(shí)還念不出它的名字。到了其可以不需要Matrix就能進(jìn)行測(cè)定，頓時(shí)感到“哇，太棒了！”，于是提出了樣品申請(qǐng)。

問(wèn)：實(shí)際用過(guò)DIUTHAME的體驗(yàn)如何？

非常吃驚，前處理的操作十分簡(jiǎn)便。在我看來(lái)，像我們這樣希望進(jìn)行質(zhì)譜成像分析的人有很多，但恐怕也有著和我們一樣的困境。

我覺(jué)得質(zhì)譜用戶是十分廣泛的。其中，只有業(yè)界極少的一部分高端用戶會(huì)同時(shí)擁有質(zhì)譜儀以及其周邊的一些設(shè)備，但往下的一部分用戶，比如我們，只擁有MALDI-TOF-MS，但沒(méi)有特定的輔助質(zhì)譜成像分析的裝置、噴霧器等設(shè)備。再往下看，一些既不太了解質(zhì)譜分析，又想做一點(diǎn)什么的人，也是大大存在的。從此意義上來(lái)說(shuō)，對(duì)質(zhì)譜成像分析感興趣，卻沒(méi)能力進(jìn)行的潛在用戶還是相當(dāng)多的。

DIUTHAME操作的簡(jiǎn)便性，對(duì)于一般的用戶來(lái)講是特別具有吸引力的。有的用戶提出想嘗試做成像的時(shí)候，來(lái)自設(shè)備廠家的提案可能是300-1000萬(wàn)日元的Matrix蒸鍍?cè)O(shè)備或是噴霧設(shè)備。對(duì)于這樣昂貴的設(shè)備，一般的用戶能輕易地說(shuō)“買！”？再者，考慮到研究成功與否的風(fēng)險(xiǎn)，要進(jìn)行這么大筆的投資我認(rèn)為是很難的。1000萬(wàn)日元都已可購(gòu)買三重四級(jí)桿的LC-MS設(shè)備了，而這也對(duì)實(shí)驗(yàn)室來(lái)講會(huì)更為穩(wěn)妥。

于是，有的用戶很有可能就會(huì)先購(gòu)入3-4萬(wàn)日元的便宜的氣刷，而購(gòu)入后翻看文獻(xiàn)時(shí)又了解到，想得到好畫(huà)質(zhì)，在氣刷前還需要蒸鍍?cè)O(shè)備。這時(shí)，用戶們心里不禁會(huì)“誒！”的發(fā)出一聲嘆息。而這種事情，需要詢問(wèn)專門做質(zhì)量分析的實(shí)驗(yàn)室才知道。

比較幸運(yùn)的是，我們中心有專業(yè)做質(zhì)譜成像分析的老師可以進(jìn)行教導(dǎo)，在多方面的嘗試下，最終也可以完成測(cè)定。而沒(méi)有堅(jiān)持到最后，甚至都沒(méi)有進(jìn)入方法探討階段就已經(jīng)放棄的用戶，想必也有不少。

如我們一樣的用戶，一般對(duì)使用DIUTHAME是抱著“先試試看”的態(tài)度。在注意不要破壞幾微米膜的部分之下，將DIUTHAME貼緊有液體的待測(cè)樣本，就可以完成前處理工作了。當(dāng)然，這和DIUTHAME的定價(jià)也有關(guān)系，如果并不昂貴的話也會(huì)更容易去選擇嘗試。

問(wèn)：DIUTHAME的出現(xiàn)降低了質(zhì)譜成像分析的門檻，對(duì)于之前比較少接觸質(zhì)譜分析設(shè)備的用戶來(lái)講，應(yīng)該有很大的幫助吧？

是的。潛在用戶也是相當(dāng)廣泛的，所以我認(rèn)為應(yīng)該讓更多的、不同領(lǐng)域的人去嘗試使用DIUTHAME會(huì)更好。

DIUTHAME的原理和SALDI相同，所以相對(duì)于MALDI法更容易產(chǎn)生碎片。也就是說(shuō)，有些物質(zhì)能看見(jiàn)，有些就很難看見(jiàn)。因此，如果在待檢化合物已確定的情況下，可以在成像之前使用DIUTHAME，看看化合物能否單獨(dú)檢測(cè)出來(lái)。

另外，我們也非常希望干燥的的食品樣品也可以像動(dòng)物組織切片這樣，只需“只要放在上面”的簡(jiǎn)易操作就能完成前處理。而DIUTHAME具有高重現(xiàn)性的特點(diǎn)，非常適合用于樣品間異同的比較，作為研究來(lái)講也十分有趣�？傮w來(lái)說(shuō)，作為一種研究工具，我們是非常有意愿使用的。

問(wèn)：我們也希望更多的用戶可以體驗(yàn)到DIUTHAME的優(yōu)點(diǎn)。在使用DIUTHAME的過(guò)程中，還有什么印象比較深刻的小故事嗎？

以前使用MALDI法，采用Matrix進(jìn)行測(cè)定時(shí)，圖像上有時(shí)會(huì)出現(xiàn)條紋。但使用DIUTHAME后就不再出現(xiàn)了。當(dāng)時(shí)為此苦惱了好幾個(gè)月，后來(lái)才知道是“導(dǎo)電不好”這樣一個(gè)極簡(jiǎn)單的原因，其實(shí)這也是教科書(shū)上有寫(xiě)到的。

但當(dāng)時(shí)這是個(gè)盲點(diǎn)，沒(méi)能理解。而在后來(lái)恍然大悟的同時(shí)，依然也覺(jué)得“果然還是DIUTHAME方便”！

問(wèn)：也許，許多其他用戶也有被這樣簡(jiǎn)單的問(wèn)題困擾的情況吧？

對(duì)于進(jìn)行質(zhì)譜成像分析的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，或接受過(guò)相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)的人來(lái)說(shuō)，這些應(yīng)該是常識(shí)性的問(wèn)題。但對(duì)于我們來(lái)講則不一樣。

比如，在涂布Matrix時(shí)，應(yīng)該不要讓載玻片傾斜，而是接近直立的狀態(tài)下進(jìn)行涂布。像這樣的操作小技巧，我們沒(méi)法馬上就了解，都是在幾個(gè)月的測(cè)定匯總，通過(guò)分析錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)及產(chǎn)生原因，才慢慢了解到的。

問(wèn)：今后在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)以及應(yīng)用方面，對(duì)DIUTHAME有什么期望嗎？

首先，希望DIUTHAME的名字可以更加廣泛地在質(zhì)譜分析領(lǐng)域中被知曉。

另外，如果能有比18mm更大尺寸的產(chǎn)品，可以容納一條斑馬魚(yú)就更好了。其實(shí)也就是希望DIUTHAME有更多可選的尺寸，能夠滿足用戶測(cè)定各式目標(biāo)樣品的不同需求。比如，并列的連續(xù)切片，或較大的樣品，若能集中到1片DIUTHAME來(lái)做就好了。這樣的話，或許能得到連續(xù)切片模擬的3D圖像。

目前濱松DIUTHAME系列產(chǎn)品尺寸一覽

關(guān)于應(yīng)用，我們周圍有很多植物學(xué)家，也希望推進(jìn)植物樣品方面的成像。生物上有意思的現(xiàn)象如果無(wú)法看到的話，則很難得出成果，所以植物和動(dòng)物都是一樣的，使用DIUTHAME到底能看清什么，這是我們這些用戶關(guān)心的問(wèn)題。

濱松致力于光電技術(shù)探索60余年，在質(zhì)譜探測(cè)器的研究也已有40余年的歷史，可為質(zhì)譜應(yīng)提供MCP、EM、離子化光源等產(chǎn)品。

除了DIUTHAME，2018年濱松還推出了一系列應(yīng)用于質(zhì)譜的新品，并在2018年ASMS中有所展示（包括在研品），如可解決小質(zhì)譜低真空問(wèn)題的三級(jí)結(jié)構(gòu)的GEN3 MCP、適用于TOF-MS的MCP+AD、適用于Q-MS\IT-MS的管道型EM等等。

濱松希望通過(guò)探測(cè)技術(shù)的原始創(chuàng)新，從最底層技術(shù)出發(fā)，穩(wěn)定而堅(jiān)實(shí)地推動(dòng)最終質(zhì)譜應(yīng)用的發(fā)展。