Nanolive實時無標記斷層掃描3D成像技術揭示病毒誘導的細胞病理反應機制

細胞病變效應（CPE）是指病毒對組織培養(yǎng)細胞侵染后產生的細胞變性，是感染的標志。CPE可通過相差顯微鏡或熒光顯微鏡觀察，但會產生光毒性，此次研究我們通過Nanolive數(shù)字全息斷層顯微術（DHTM）具有獨特的最小干擾的方式揭示活細胞中病毒感染的模式。DHTM通過無標記的方式記錄低劑量的光通過透明樣本表面的相差位移。DHTM基于折射率（RI）推斷3維（3D）斷層圖像。通過測量RI和計算折射率梯度（RIG）值，DHTM在光學上揭示細胞在病毒感染時的異質性。我們發(fā)現(xiàn)痘苗病毒（VACV）、單純皰疹病毒（HSV）和鼻病毒（RV）感染，RIG逐漸明顯增加。VACV，而不是HSV和RV感染引起細胞體積變化，但三種病毒都會改變細胞質膜動力學和誘導凋亡特征類似于化學復合物癌基因抑活藥，具有病毒特異性特征。

實驗過程

用帶GFP標簽的VACV病毒感染hela細胞，之后通過Nanolive 全息3D顯微鏡對感染早期到后期的細胞，非感染的細胞、阿糖胞苷處理的感染與非感染的細胞分別成像（2小時到8小時），記錄細胞折射率（RI）變化過程并標成偽彩。

1. 對感染和非感染細胞感染早期和感染8小時成像，RI分析發(fā)現(xiàn)細胞感染8小時折射率梯度增加了3倍，而非感染的細胞，折射率梯度沒有改變，如下圖所示。

2.感染細胞、非感染細胞，阿糖胞苷處理的感染細胞，對不同時間點分別成像，分析折射率梯度變化，阿糖胞苷處理的感染細胞折射率僅增加了1.3倍，因阿糖胞苷會抑制VACV晚期基因的表達，該數(shù)據揭示細胞折射率梯度的改變主要由VACV晚期基因表達引起；且阿糖胞苷處理的感染細胞早期產生的濾泡比未處理的感染細胞多，后期和非處理的細胞沒有明顯的差別。

3.星形孢霉素誘導細胞凋亡的折射率變化：0-4小時，折射率梯度逐漸增加，5小時后略有減少。

4.通過Nanolive全息3D成像技術，測量了不同處理細胞的體積大小，發(fā)現(xiàn)因細胞體積的變化，導致細胞質濃度增加，引起了細胞折射率梯度變化，從而全面揭示了病毒感染引起的細胞病變的效果及過程。

總之，我們引入的DHTM技術實現(xiàn)了感染性研究的無標記定量分析，對活細胞以最小感染的方式揭示了病毒類型特異性變化及細胞病變。

經典的視頻增強型相差光學顯微鏡，如干涉顯微鏡和亮場顯微鏡因衍射極限導致圖像不均勻，缺乏斷層信息和聚焦依賴的結構膨脹，相反，DHTM可以延長定量時間分辨的3D圖像，通過低功率的激光（520nm,一級，0.2mW/mm2），不會在高時間和空間分辨率下產生光毒性。

總結：

Nanolive 的全息斷層3D成像技術優(yōu)于經典光學技術，如層析相顯微鏡和衍射相顯微鏡，Nanolive不但高靈敏度、高精度，且采用非侵入性檢測。系統(tǒng)可在高空間和時間分辨率上獲得定量的3D信息。且可很容易地測量細胞體積及亞細胞結構，還可以用于獲取兩個新維度的細胞數(shù)據：RI及RIG,這是其他顯微成像系統(tǒng)不能評估的。這個算法強大，解決了活細胞病理成像的一系列技術限制，包括通過化學物或遺傳編碼的熒光素標記細胞及病毒，成像過程中的光毒性等。非侵入性與低侵入性的Nanolive 全息斷層3D成像技術采用低功率激光，為活細胞研究提供了一個前所未有的適用工具。

Nanolive 3D顯微成像技術病毒感染及藥物研究優(yōu)勢：

﹡非侵入式或無需染色標記；

﹡實驗處理低于5分鐘；

﹡實時監(jiān)測細胞特性；

﹡斷層掃描---96重Z軸堆疊；

﹡任意的數(shù)字染色高達9色；

﹡納米級分辨率；

﹡2秒鐘快速3D全息成像；

﹡無標記IHC,IF組織學與細胞學研究；

﹡整合3通道熒光，最高同時10色標記，完整活細胞解決方案；