利用基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的神經(jīng)突生長測(cè)定法進(jìn)行神經(jīng)毒性和神經(jīng)元發(fā)育的評(píng)估

介紹

對(duì)環(huán)境中未經(jīng)檢驗(yàn)的化學(xué)品日益普遍的關(guān)注已經(jīng)產(chǎn)生了開發(fā)可靠和有效的篩選工具以識(shí)別可能影響人類健康的，特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)的迫切需求。

我們?cè)u(píng)估了一種神經(jīng)突向外生長的測(cè)定方法，通過篩選和表征所選化合物的活性，評(píng)估其是否可能對(duì)發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。選擇該測(cè)定法是因?yàn)槠湓谏窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵過程的模型具有一定相關(guān)性，特別是神經(jīng)元會(huì)通過延伸其神經(jīng)突以形成完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。破壞這一過程可能會(huì)對(duì)人類和嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生不利影響，因此研究表明，未成熟、發(fā)育中和成熟的神經(jīng)突是化學(xué)毒性的靶標(biāo)。

雖然神經(jīng)突向外生長測(cè)定主要用于評(píng)估發(fā)育神經(jīng)毒性，但也可用于評(píng)估通過檢測(cè)神經(jīng)突收縮的神經(jīng)變性。此外，該測(cè)定還有可能與評(píng)估成年神經(jīng)元中的神經(jīng)可塑性相關(guān)。對(duì)于篩選測(cè)定，總神經(jīng)突向外生長通常是指標(biāo)報(bào)告中最常見的度量標(biāo)準(zhǔn)。利用自動(dòng)成像還能夠?qū)ζ渌�特征進(jìn)行多參數(shù)評(píng)估，例如總分支數(shù)和總過程數(shù)，以評(píng)估化合物可抑制神經(jīng)突向外生長的不同方式。

材料

•ImageXpressNano自動(dòng)成像系統(tǒng)，配備CellReporterXpress自動(dòng)圖像采集和分析軟件(MolecularDevices)
•iCell®神經(jīng)元(CellularDynamicsInternational)
•Poly-d-賴氨酸預(yù)包被384孔板(CorningLifeSciences)
•層粘連蛋白(Sigma-Aldrich)
•多聚甲醛(Sigma-Aldrich)
•胎牛血清(Sigma-Aldrich)
•β-微管蛋白III(TUJ-1)(BDBiosciences)
•Hoescht(ThermoFisherScientific)
•抗β-微管蛋白抗體(BDBiosciences)
•CalceinAM(ThermoFisherScientifiic)

利用基于iPS細(xì)胞的神經(jīng)突生長測(cè)定法鑒定具有神經(jīng)毒性的化合物

由國際細(xì)胞動(dòng)力學(xué)會(huì)(CDI)提供的人iPSC衍生的神經(jīng)元(即iCell神經(jīng)元)細(xì)胞，是由有絲分裂后GABA活性基團(tuán)和谷氨酸能神經(jīng)元組成的混合物。這些研究中使用的神經(jīng)元已經(jīng)由制造商培養(yǎng)成完全分化和純化的細(xì)胞群，并已形成對(duì)神經(jīng)元標(biāo)志物β-III微管蛋白和MAP28呈陽性的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞收到時(shí)為冷凍狀態(tài)，隨后解凍并根據(jù)CDI推薦的方案鋪板。將細(xì)胞接種在聚-d-賴氨酸預(yù)包被的384孔板上，并用3.3μg/mL層粘連蛋白進(jìn)行處理。在化合物處理之前，每孔接種7,500個(gè)細(xì)胞，并在iCellNeurons培養(yǎng)基中生長48小時(shí)。這些細(xì)胞中的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)通常在接種后約24小時(shí)開始形成，并且在培養(yǎng)至10-12天時(shí)開始增加復(fù)雜性。在接種后48小時(shí)，我們神經(jīng)突向外生長進(jìn)行評(píng)估，與此同時(shí)，神經(jīng)元也可能發(fā)生神經(jīng)突萎縮。在6種濃度范圍(0.3,1.0,3.0,10.0,30.0和100μM)中一式兩份測(cè)試化合物。每個(gè)平板中包括多個(gè)DMSO對(duì)照(n=16)和未處理的對(duì)照(n=16)。使用高達(dá)0.3％的DMSO來評(píng)估測(cè)定中的溶劑效應(yīng)。將細(xì)胞在37℃和5％CO2下暴露于化合物下72小時(shí)。接著，除去培養(yǎng)基，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞2小時(shí)。用含有1％胎牛血清和0.01％皂苷的PBS中的進(jìn)行透化。隨后，將細(xì)胞與抗β-微管蛋白III(TUJ-1)抗體(1:100稀釋)和2μg/mLHoechst的結(jié)合AF488染料的小鼠抗人抗體孵育3小時(shí)。β-微管蛋白用作神經(jīng)突向外生長的標(biāo)記物，也用于完整神經(jīng)元細(xì)胞體的計(jì)數(shù)。溫育后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)替換染色溶液。或者，還可以使用活細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)毒性測(cè)定，用鈣黃綠素AM和Hoechst染料(分別為0.5μM和2μM)染色30分鐘。有關(guān)接種密度優(yōu)化的詳細(xì)信息和384孔格式測(cè)定的方案在Sirenkoetal.6中有詳細(xì)描述。

使用ImageXpressNano自動(dòng)成像系統(tǒng)的10倍PlanFluor物鏡拍攝各孔的圖像。在384孔板中的每個(gè)孔的單個(gè)位點(diǎn)捕獲一個(gè)10x圖像。10x物鏡提供了足夠的分辨率來區(qū)分每個(gè)圖像中大量細(xì)胞(500-1,000)的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能覆蓋表總孔面積的約1/4。在獲取圖像之后，使用CellReporterXpress™自動(dòng)圖像采集和分析軟件完成所有圖像分析，該軟件包含用于神經(jīng)突向外生長和活力評(píng)估的圖像處理應(yīng)用模塊。作為圖像處理的示例，圖1表示出了來自神經(jīng)突圖像和相應(yīng)分析圖層的放大的典型圖像。圖2顯示來自DMSO處理的神經(jīng)元和化合物處理的神經(jīng)元的圖像，在其相應(yīng)結(jié)構(gòu)上有軟件追蹤的覆蓋圖層。

^{圖 1 ß-微管蛋白 ( 綠色 ) 染色的圖像和對(duì)照細(xì)胞的軟件分析軌跡。將 iCell 神經(jīng)元鋪板培養(yǎng) 5 天，然后 固定，并用 AF 488 結(jié)合的抗-β-微管蛋白 (TUJ-1) 抗體 (1:100) 染色。圖像由 ImageXpress Nano 系統(tǒng) 使用 10x Plan Fluor 物鏡和 FITC 通道拍攝。使用 CellReporterXpress 軟件中的 Neurite Tracing 分析 算法處理圖像。右側(cè)的分析圖層顯示細(xì)胞生長 ( 綠色 ) 和細(xì)胞體 ( 藍(lán)色 )}

^{圖 2 ß-微管蛋白 ( 綠色 ) 和 Hoechst ( 藍(lán)色 ) 的復(fù)合圖像，顯示對(duì)照細(xì)胞和用所選化合物處理的細(xì)胞 的分析軌跡。將 iCell 神經(jīng)元鋪板 48 小時(shí)，用化合物處理 72 小時(shí)，然后固定并用 Hoechst (2 μM) 和 帶 AF 488 熒光的抗 TUJ-1 抗體 (1:100) 進(jìn)行組合染色。圖像由 ImageXpress Nano 系統(tǒng)使用 10x Plan Fluor 物鏡進(jìn)行 DAPI 和 FITC 通道拍攝。使用 CellReporterXpress 軟件中的 Neurite Tracing 分 析算法處理圖像。觀察到用指定化合物處理的神經(jīng)元中破壞的神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞死亡。​}

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