Biopen助力肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈在活細(xì)胞內(nèi)磷酸化動(dòng)態(tài)過程的定量觀測

調(diào)節(jié)輕鏈（RLC）的磷酸化引起非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NMMⅡ）與肌動(dòng)蛋白纖維的匯合，從而導(dǎo)致肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞骨架的形成與收縮。NMMII在細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，但是如何在亞細(xì)胞水平精確的調(diào)控RLC的磷酸化水平仍舊未知。

目前的研究手段并不適合用于觀測活細(xì)胞及生物體內(nèi)的RLC磷酸化。例如使用雙色熒光共振成像技術(shù)的局限在于：占用大部分可用光譜導(dǎo)致無法兼容其它光學(xué)傳感器并且存在光毒性與光漂白現(xiàn)象。本研究開發(fā)了一種同源FRET方法用于觀測熒光蛋白標(biāo)記的RLC磷酸化。

如圖1A所示，磷酸化導(dǎo)致RLC二聚體的解離，減弱FRET，異向性增加。將融合有熒光蛋白的RLC轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)在玻璃皿及鍍有纖連蛋白的玻璃皿中，發(fā)現(xiàn)鍍有纖連蛋白的實(shí)驗(yàn)組異向性顯著升高。并且RLC突變體AA（缺少磷酸化位點(diǎn)）實(shí)驗(yàn)組的異向性明顯降低。

接下來使用mCherry-RLC來探究活細(xì)胞內(nèi)RLC-FRET的動(dòng)力學(xué)。MLCK能夠磷酸化RLC，如圖2A所示，ML-7處理抑制MLCK活性后，mCherry-RLC的異向性明顯降低。將mCherry-RLC同MLCK FRET生物傳感器共表達(dá)，使用KCL激活MLCK后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)mCherry-RLC的極化也同樣增加。

接下來，研究人員需要進(jìn)行單細(xì)胞刺激以觀察亞細(xì)胞水平的肌球蛋白磷酸化動(dòng)態(tài)過程。在細(xì)胞收縮前，細(xì)胞外突出包含穩(wěn)定的高異向性磷酸化區(qū)域（圖3B），之后使用Biopen對細(xì)胞外突出進(jìn)行PDGF刺激，瑞典Fluicell公司的單細(xì)胞微流控給藥系統(tǒng)Biopen采用高端的微流控技術(shù)，可以在顯微鏡下精確的控制液體覆蓋范圍，如圖中若丹明紅色染料所覆蓋區(qū)域即為本次實(shí)驗(yàn)的刺激區(qū)域。首先，細(xì)胞骨架收縮10-20μm（圖3C，白色箭頭），收縮前端的RLC異向性的提高（圖3C，粉色箭頭前方），肌球蛋白的去磷酸化，包括收縮前端（圖4C，粉色箭頭下方）和內(nèi)部（圖3C，藍(lán)色箭頭）。整個(gè)過程收縮邊緣肌球蛋白RLC的異向性改變定量統(tǒng)計(jì)見圖3D，mCer3-RLC(AA)邊緣的異向性無明顯改變，野生型的RLC異向性明顯降低。

Biopen利用吸入流的流速高于注入流的流速所形成的表面張力，自動(dòng)形成液流回路，將細(xì)胞培養(yǎng)體系與灌流液體通過虛擬邊界分離，產(chǎn)生局部液流腔。液流腔的大小可控制在培養(yǎng)細(xì)胞或組織中單個(gè)細(xì)胞周圍的環(huán)境。5-25nL/s亞秒級的給藥速度，可實(shí)現(xiàn)4種不同藥液的快速切換。

借助于我們的單細(xì)胞微流控給藥系統(tǒng)，研究人員完成了單細(xì)胞水平的肌球蛋白磷酸化研究，建立了一種兼容多種不同熒光蛋白與生物傳感器的檢測方法，可以說Biopen實(shí)乃單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大利器!

Biopen 技術(shù)優(yōu)勢

★精確的單細(xì)胞或多細(xì)胞藥物環(huán)境控制分子；

★低藥物消耗，35µL/孔；

★4種溶液快速切換；

★無需清洗；

★非接觸式給藥，無污染；

★槍頭頂部非玻璃材質(zhì)高分子軟性材料，不易碎，避免損傷細(xì)胞；

★最大限度利用培養(yǎng)的細(xì)胞；

★兼容各大品牌正倒置顯微成像系統(tǒng)；

Biopen 應(yīng)用領(lǐng)域

★酶學(xué)；

★電生理；

★藥理；

★組織病理；

★藥物發(fā)現(xiàn)；

★生物打�。�